组织育苗一、植物组织培养概况植物组织培养(planssueculture)是指在无菌条件下，将离体的植物器官(根、茎、叶、花、果实、种子等)、组织(如形成层、花药组织、胚乳、皮层、细胞及原生质体培养在人工配置的培养基上，并给以适合其生长发育的条件是其分生出新植株统称为组织培养。二、植物组织培养的分类与应用(一)植物组织培养的分类依据培养方式分类依据培养方式植物组织培养可分为固体培养、液体培养两类，后者又分为静止培养、振荡培养等类型。(1)固体培养这是应用最为广泛而普遍的一种培养方法，就是在培养基中加入一定量的凝固剂。琼脂是目前广为采用的良好凝固剂，用时加热使之溶解后，经冷却即凝固成固体培养基。这种培养方法的最大优点是使用方便。占地不大，只要有安放培养物用的培养架地方即可，无需其他特殊设备，在条件不够充分时，可以因陋就简开展培养工作。固体培养亦存在较多缺点：①培养的外植体无法全部浸没在培养基中，只能有部分组织与培养基直接接触，因此在培养过程中，由于接触培养基的组织将营养物质很快吸收掉，而他处养分因流动缓慢补充不及时 ，常造成培养物接受养分不均和营养缺乏，以致引起组织生长的各种差异。②培养物插入固体培养基的部分，常会出现气体交换不畅，而影响外植体组织的呼吸作用。③由于固体培养基不能使培养物获得均一的细胞群体，因而就不可能以固体培养方法来进行某些生理代谢方面的研究。（2)液体培养培养基中不加任何凝固剂，经消毒后培养物直接置于液体中培养。这种培养方法的优点较多，主要有：培养物吸收营养比较充分，气体交换条件好，容易获得均一的组织群体，且便于进行各种生长 、生理特性以及物质代谢等方面的研究。缺点是转换培养基比较麻烦。一般又分静止培养和振荡培养两种形式。静止培养：大都在培养液中用滤纸裁剪成条，然后将纸的两端弯曲折成桥状形式，滤纸桥身紧贴于培养液表面，两端则插入溶液中，直至试管底或三角烧瓶底，使营养液渐渐渗入滤纸，培养物则置于滤纸桥面，通过纸桥源源不断地供给养分。在某些情况下也可将被培养物直接放人液体培养基中培养。振荡培养：这是理想的培养方法，它既能使培养物在培养过程中均匀地接触到培养基，又能保持良好的通气条件。现在采用的有四种不同类型的培养方式，主要依据培养液的流动方式来划分。① 慢速旋转培养。在扁平的大圆盘上装有多个凸起的玻璃瓶，内装培养液，圆盘以 1-2r／min 的低速旋转，瓶内的外植体交替地浸没在培养基中和露出于空气中，这样既能保证营养基得到充分混合，又使组织块获得较好的气体交换条件。② 振荡培养。这是一种比较简单而比悬浮培养效果更好的培养方法，用三角烧瓶盛装悬浮培养物置平台式振荡器上，以往复形式或旋转方式进行振荡培养，这种培养方法广泛用于多种外植体的悬浮液培养，摆幅3cm，每分钟 60—80 次的转速对多数培养物都较适宜。③ 白旋式培养。这种培养方法是装有一个固定的架子，培养架倾斜成 45。角，每分钟转速为 80—120 次，适于大容量悬浮培养。④ 搅拌培养。这种培养方法的容器是固定的，把培养基储存器和气体补给器装置连接起来，培养容器用一个 5L 的圆底玻瓶，装一个大直径的凸边插头，盖上一个有五孔眼的反应瓶盖，大瓶基部装一个磁性搅拌器置培养液中，在容器外面用一个小的同步电动机带动一块大磁铁，使之内部磁铁随外部磁铁而运动，一般采用 100-200r／min 的转速较好。这种培养方法的主要优点是可使培养液保持均匀分散和有效的进行气体交换。植物组织或细胞不论采用何种培养方法，在培养基上培养一定时间后，由于养分的消耗，也分别散失，在生长过程中逐步积累了一些组织的代谢产物，（二） 根据被培养的植物组织部位分类根据被培养的植物组织部位可分为植株培养、胚胎培养、器官培养、组织培养、细胞培养、原生质体培养。植株培养：是对完整植株材料的培养，如幼苗及较大植株的培养。胚胎培养：指以从胚珠中分离出来的成熟或未成熟胚为外植体的离体无菌培养。器官培养：指以植物的根、茎、叶、花、果等器官为外植体的离体无菌培养，如根的根尖和切段，茎的茎尖、茎节和切段，叶的叶原基、叶片、叶柄、叶鞘和子叶，花器的花瓣、雄蕊（花药、花丝）、胚珠、子房、果实等的离体无菌培养。组织培养：指以分离出植物各部位的组织（如分生组织、形成层、木质部、韧皮部、表皮、皮层、胚乳组织、薄壁组织、髓部等），或已诱导的愈伤组织为外植体的离体无菌培养。这是狭义的植物组织培养。细胞培养：指以单个游离细胞（如用果酸酶从组织中分离的体细胞，或花粉细胞，卵细胞）为接种体的离体无菌培养。 原生质体培养：指以除去细胞壁的原生质体为外植体的离体无菌培养。（三）植物组织培养在园林植物育苗上的应用随着经济的发展，人民生活水平不断提高，对绿化美化环境的要求迫切，对园林植物的花色品种和质量的要求也日益提高，为促进园林植物生产的迅速发展，国际上已广泛采用植物组织培养技术来解决生产中的质量问题。特别是植物器官的培养技术，从 20 世纪 60 年代开始即走出实验室，进人生产领域。西欧和东南亚国家，利用植物组织培养方法，快速繁殖兰花的数量已达 35 个属 150 多种。三 组织培养的基本设施设备一个标准的组织培养实验室应当包括：洗涤室、配置室、无菌室、培养室、观察室等。在实际中可结合可行条件，合并一部分。（一）洗涤室(cleaning room)洗涤室用于完成玻璃器皿等仪器的清洗、干燥和贮存。室内应配备大型水槽，最好是白瓷水槽。为防止碰坏玻璃器皿，可铺垫橡胶。上下水道要畅通。备有塑料筐，用于运输培养器皿。备有干燥架，用于放置干燥涮净的培养器皿。（二）准备室(repairing room)准备室要求明亮、通风。在准备室内要完成培养基制备以及试管苗出瓶、清洗与整理工作。如果房间较多，可将准备室分为洗涤室和配置室两部分。洗涤室专门负责试管苗出瓶与培养器皿的清洗工作；配置室则负责培养基的配制、分装、包扎和高压灭菌等工作。（三）缓冲室进入无菌室前要在缓冲室里换上经过灭菌的卫生服、拖鞋，戴上口罩。应当在此室内安装灭菌用的紫外灯。控制无菌室及培养室的配电板等。（四）无菌操作室（transfering room）接种室是进行植物材料的分离接种及培养物转移的一个重要操作室。其无菌条件的好坏对组织培养成功与否起重要作用。在工作方便的前提下，接种室宜小不宜大，一般 7～8m2，要求地面、天花板及四壁尽可能密闭光滑，易于清洁和消毒。配置拉动门，以减少开关门时的空气扰动。接种室要求干爽安静，清洁明亮。在适当位置吊装 1-2 盏紫外线灭菌灯，用以照射灭菌。最好安装一小型空调，使室温可控，这样可使门窗紧闭，减少与外界空气对流。（五)培养室（culturing room） 培养室是将接种的材料进行培养生长的场所。培养室的大小可根据需要培养架的大小、数目、及其他附属设备而定。其设计以充分利用空间和节省能源为原则。高度比培养架略高为宜，周围墙壁要求有绝热防火的性能。培养材料放在培养架上培养。培养架大多由金属制成，一般 设 5 层，最低一层离地高约 l0cm，其他每层间隔 30cm 左右，培养架即高 1.7m 左右。培养架长度都是根据日光灯的长度而设计，如采用 40W 日光灯，则长 1.3m，30W 的长 lm，宽度一般为 60cm。培养室最重要的因子是温度，一般保持在 20～27℃左右，具备产热装置，并安装窗式或立式空调机。由于热带植物和寒带植物等不同种类要求不同温度，最好不同种类有不同的培养室。室内湿度也要求恒定，相对湿度以保持在 70％～80％为好，可安装加湿器。控制日光照时间可安装定时开关钟，一般需要每天光照 10～16h 也有的需要连续照明。短日照植物需要短日照条件，长日照 植物需要长日照条件。现代组培实验室大多设计为采用天然太阳光照作为主要能源，这样不但可以节省能源，而且组培苗接受太阳光生长良好，驯化易成活。在阴雨天可用灯光作补充。（六）驯化室驯化室要求清洁无菌，配有空调机、加湿器、恒温恒湿控制仪、喷雾器、光照调节装置、通风口以及必要的杀菌剂。（七）温室应配有空调机、通风口、加湿器、恒温恒湿控制装置、喷雾装置、光照调节装置以及必要的杀菌杀虫装置及相应药剂。仪器设备和器皿用具（一）仪器设备（见实验室设计）1．超净台，优点是操作方便自如，比较舒适，工作效率高，准备时间短。开机 10 分钟即可操作，可进行长时间使用。在工厂化生产中，接种工作量很大，需要经常长久地工作时，超净台是很理想的设备。超净台功率在 145～260W 左右，它装有小型鼓风机，使空气穿过一个前置过滤器，在这里把大部分空气尘埃先过滤掉，然后再使空气穿过一个细致的高效过滤器，它除去了大于 0.3um 的尘埃、细菌和真菌孢子等，最后以 较洁净的气流吹到工作台面。超净空气的流速为每分钟 24～30m，这已足够防止附近空气袭扰而引起的污染，这样的流速也不会妨碍采用酒精灯对器械等的灼烧消毒。在这样的无菌条件下操作，就可以保证无菌材料在转移接种过程中不受污染。超净台分水平式和垂直式二种型号。2．无菌箱，在投资少的情况下，可以用接种箱来代替超净台。接种箱依靠密闭、药剂熏蒸和紫外灯照射来保证内部空间无菌。但操作活动受限制，准备时间长，工作效率低。3．空调机，保证室内温度，一般为 25±2℃，应安置在室内较高的位置。以便于排热散凉。4．除湿机，培养室的湿度应为 70～80%，湿度过高易长杂菌，湿度过低培养器皿内的培养基会失水变干，影响培养物的生长。5．恒温箱，用于植物材料的培养，可以控制温度、湿度及光照等。6．烘箱，用于干燥洗净的玻璃器皿，也可用于干热灭菌和测定干物重。用于干燥需保持 80～100℃；进行干热灭菌需保持 150℃，达 1～3h；若测定干物重，则温度应控制在 80℃烘干至完全干燥为止。7．高压灭菌锅，用于进行培养基和器械用具的灭菌。小规模实验室可选用小型手提式高压灭菌锅。如果是连续的大规模生产，应选用大型立式的或卧式的高压灭菌锅。通常以电作能源。8．冰箱，主要用于贮存母液、各种易变质、易分解的化学药品以及植物材料等。9．电子分析天平和托盘天平，电子分析天平，用于称取大量元素、微量元素、维生素、激素等微量药品精确度为 0.0001g；托盘天平用于称取用量较大的糖和琼脂等，其精确度为 0.1g。天平应放置在干燥、不受震动的天平操作台上。10．显微镜及解剖镜，种类较多，用于分离微茎尖可采用双筒实体解剖镜。双筒解剖镜在分离茎尖等较小组织时，便于观察、操作，通常放大 5-80 倍。放大 40 倍以上操作需要有相当熟练的技术和较好的工具。为进行操作，要有照明装置。解剖镜上带有照相装置，根据需要随时对所需材料进行摄影记录。11．水浴锅，用于溶解难溶药品和熔化琼脂条12．摇床与转床、用于改善液体培养材料的通气状况及促进酶解原生质体的解离。一般在液体培养中转速为每分钟 100 次左右，在解离原生质体时为每分钟 80 左右。13．磁力搅拌器，磁力搅拌器用于加速搅拌难溶的物质，如各种化学物质、琼脂粉等。磁力搅拌器还可加热，使之更利于溶解。14．电蒸馏水器，电蒸馏水器，采用硬质玻璃或金属制成。蒸馏水用于配制母液或培养基，配制培养基可用自来水来代替，若实验要求严格的话，则须用蒸馏水。15．酸度计，组织培养中培养基 pH 值的准确度是十分重要的，应当使用酸度计，若无酸度计，也可使用pH 试纸进行粗测。首次使用酸度计前，应用标准液调节定位，然后固定。测量 pH 值时，待测液必须充分搅拌均匀。如果培养基温度过高，测量时要调整 pH 值计上的温度扭使之和培养基温度相当。注意保护好玻璃电极，用后电极应用蒸馏水冲洗净，盖上电极帽。16、离心机，用于收集原生质体，转速要求较低。一般为 1000～4000rpm 即可。（二）各类器皿1．培养器皿：在组织培养中配制培养基和进行培养需大量的玻璃器皿。要求由碱性溶解度小的硬质玻璃制成，以保证长期贮存药品及培养的效果；培养用的还要求透光度好，能耐高压高温，能方便放人培养基和培养材料的器皿，根据培养的目的和要求，可以采用不同种类、规格的玻璃器皿。其中以试管、三角瓶、培养皿等使用较多。最常使用的是三角瓶，规格有 l00ml，250ml，500ml 等，一般使用 l00ml 三角瓶，无论静止或振荡培养皆适用。其培养面积大，利于组织生长，受光也比试管好。由于瓶口较小，亦不易污染。培养皿常用 9、12cm 直径等规格，要求上、下能密切吻合。这在游离细胞、原生质体、花粉等的静置培养、看护培养、无菌种子的发芽、植物材料的分离等都需采用。试管常用 18mmXl80mm 或 20mmX200mm 规格。可用于培养较高的试管苗，另外也不易污染。培养器皿还可就地取材，采用一些代用品。工厂化生产可采用广口的 200ml 罐头瓶，加盖半透明的塑料盖，由于瓶口大，所以大量繁殖时操作方便、工作效率高，也减少了培养材料的损伤。但缺点是易引起污染。目前，培养容器和制备培养基所需的玻璃器皿逐渐被塑料器皿所代替。塑料容器具有质轻、透明、不易破碎、成本低等优点，如培养容器多为平底方盒形，可提高培养空间利用率的植株数，并能一层层地叠摞起来，从而节约空间。这类塑料制品多是采用聚丙烯材料制成，能耐高温，可进行高压灭菌。有些产品为一次性消耗品，不但可节省洗涤人工，还可节省时间，提高效率。一次性塑料容器或带螺丝帽的玻璃瓶，无须另外配盖，使用时比较方便。瓶口封塞可用多种方法，要具有一定的通气性和密闭性，以防止培养基干燥和杂菌污染。以前封口常用棉塞。但这种封口办法夏季极易污染，且不易保持培养基的湿度。现在多采用聚丙烯塑料薄膜作为封口，以 线绳结扎或橡皮圈箍扎。为了增加通气性，可在里面衬一层硫酸纸或牛皮纸。这样经济方便，且通气好。也可采用专用的封口膜。2．分注器，小型操作时可采用烧杯直接分装。大型实验室可采用医用“下口杯”作为分装工具，在“下口杯”的下口管上套一段软胶管，加一弹簧止水夹，使用时非常合适。更大规模或要求更高效率时，可考虑采用液体自动定量灌注设备。3．离心管，用于离心收集原生质体，一般用 5ml、10ml 规格。4．刻度移液管，常用的有 0.1ml、0.2ml、0.5ml、2ml、5ml、10ml。用于配制培养基时吸取不同种类的母液。应多准备几支，分开使用。5．细菌过滤器，用于除去不能采用湿热灭菌法的液体中的细菌。一般采用 0.22um 微孔滤膜进行抽滤灭菌。包括滤头，注射器或采用抽滤装置：真空泵、吸滤瓶、滤气玻璃管等。6．实验器皿，在组织培养中配制培养基，贮藏母液，材料的消毒等需要各种化学实验用的玻璃器皿，包括 100ml、250ml、500ml、1000ml 烧杯；l0ml、l00ml、1000ml 量筒；l00ml、1000ml 试剂瓶(棕色)等等。（三）器械用具1．镊子类（forceps）常应用医疗上的镊子。根据操作需要有各种类型，若用 l00ml 的三角瓶作为培养瓶，可用 20em 长的镊子。镊子过短．容易使手接触瓶口，造成污染。镊子太长，使用起来不灵活。如在分离茎尖幼叶时，则用钟表镊子。2．剪刀类（scissors）可采用医疗五官科用的中型剪刀。主要用于切断茎段、叶片等。也可以用弯形剪刀，由于其头部弯曲，可以深入到瓶口中进行剪切。3．解剖刀切割较小材料和分离茎尖分生组织时，可用解剖刀。刀片要经常调换，使之保持锋利状态，否则切割时会造成挤压，引起周围细胞组织大量死亡，影响培养效果。4．解剖针解剖针可深入到培养瓶中，转移细胞或愈伤组织。也可用于分离微茎尖的幼叶，可以自制。5．接种工具包括接种针、接种钩及接种铲，由白金丝或镍丝制成6．钻孔器用于取肉质茎、块茎、肉质根内部的组织时采用。一般为 T 字型。口径有各种规格。7．其它包括酒精灯，电炉，试管架，搪瓷盘等多种。四、园林植物的组培育苗在我国，大多数园林植物均采用常规方法如：播种、嫁接、分株、扦插、压条等繁殖育苗，繁殖系数低 ，苗木质量差，繁殖周期长，品种推广慢。而组培育苗优势明显，近年来得到迅速的发展。下面以木槿为例，介绍园林植物的组培育苗。(一)引言木槿(Hibiscussyriacus)为锦葵科、木槿属。原产于东亚，现我国各地均有栽培，以长江流域为多。木槿是绿化、美化、净化环境的优良观赏树种，开花在 7—10 月，单办、重办，红、紫、白色丰富多彩，花期长达 4 个月。无论是道路两旁，还是街心花坛及街头游园，均可配植，且对氯气和烟尘有很强的抵抗能力 。花用来烹调作汤，味道清香；如拌面炸食，其味鲜美、有“面花”之称。皮层纤维可作纺织、造纸原料。花 、皮、种子均可人药。幼嫩叶可制饮料；老叶捣碎挤汁用来洗头，可使头发柔软光洁。木槿一般用播种法、扦插法繁殖，繁殖系数低，组织培养可以再短期内获得大量苗木。 (二)试管繁殖简史1983 年，Reynolds 取木槿子叶，下胚轴组织培养，得到再生小植株；1989 牛，李世承等采用木槿幼叶培养，获得完整植株；1988 年张颜辉等取木槿侧芽试管繁殖，取得成功。从而为木槿的组培育苗、商业化生产提供科学依据。(三)试管快繁技术1．生产工艺流程外植体(幼叶、侧芽)——诱导丛生芽壮苗培育生根培养移栽。2．快繁技术要点(1)取材、消毒和接种取木槿树上幼叶，用水洗净后，先用 70％酒精速蘸 9s，然后用 0．05％-0．1％升汞溶液消毒 7-8min，无菌水冲洗 3-5 次，置超净台上接种备用；木槿侧芽外植体要选当年生的幼嫩枝条，剪去叶片，用小软刷在自来水下清洗干净，消毒时先用 70％酒精浸泡 1—3 min，再用 0.1%升汞溶液消毒 10min 左 右，无菌水冲洗 4-6 次，接种备用。(2)幼叶培养消毒好的幼叶，剪成 0．8-1．0cm 大小，接种于 l／2MS 十 BA3．0+IAA0．1+GA30．5 十糖3％的诱导培养基上，3d 后幼叶开始卷曲、膨大，7d 左右，叶色变淡，深浅不匀。同时，在切口处或叶脉处，产生少量白色、黄色和黄绿色的瘤状物，30d 后达到高峰，并形成具茸毛的柱状物。此时，将其切割后转接于N6+BA3.2+IAA0．1+GA30．5+糖 3％的分化培养基上继代培养，芽不断分化形成新的丛生芽。经一段时间后，部分丛芽可转接于 N6+NAA2.0 十糖 2％的生根培养基上诱导生根，10 多天后，可见幼根长出。(3)侧芽培养将消毒后的木槿材料，视节间大小接种在 MS 十 NAA0．05+IBA0．05 的培养基上，10 多天后，侧芽萌动、抽生并有小叶长出；20d 后，可形成一对完整的小叶，1 月后，芽苗高可伸长至 2-5cm。然后，视芽苗大小，切割或不切割转接于 MS+BAl．0+KT0．75+NAAl．0+IBA0．2+活性炭 0．2％的培养基上，可迅速伸长，正常发育。此后，在这两种培养基上不断交替转接、继代、增值，不断扩大数量，生长较好的无根苗接于 MS+NAAl．5+IBA0．5 十糖 2．5％的培养基上诱导生根，获得完整植株。3．试管苗移栽及管理生根后的试管苗，经炼苗 10 多天后，移栽于珍珠岩+蛭石+砂土(1：1：2)的基质中，并密切注意遮荫、保湿，使试管苗逐渐适应外界环境，半月后，可渡过过渡期，其间要适当喷施杀菌剂，以防杂菌滋生。