西南大学网络与继续教育学院课程考试试题卷类别：网教 专业：农学 课程名称【编号】：细胞工程【1117】 A 卷大作业 满分：100 分一、问答题（84 分）（请选择 6 道题作答，14 分/题，共 84 分）1. 简述离体条件下生长素与细胞分裂素在细胞分化中的作用。答：离体培养中，外源激素在细胞内的吸收和代谢影响到激素的活性从而影响其培养效果。外源细胞分裂素被外植体吸收后，在细胞内首先被修饰和转化形成多种分子形式，包括活化形式和钝化形式。一般认为，细胞分裂素自由碱基形式是活性形式，而核苷形式为钝化形式，细胞分裂素进入细胞后转化成核苷形式是降低其活性的主要原因。因此，细胞分裂素自由碱基形式与核苷形式相互转换的酶学机制，可能是植物细胞内细胞分裂素活性的重要调控机制。生长素进入细胞后，一部分以游离状态存在，另一部分则与氨基酸结合形成生长素一氨基酸复合体。与生长素结合的氨基酸主要为天冬氨酸，也有谷氨酸。 2 ，4-D、NAA、IAA 是常用的 3 种生长素，前两种为化学合成生长素，IAA 为生物合成生长素，植物细胞本身也具有合成 IAA 的能力。研究认为，与细胞分裂素相似，生长素的复合体形式是钝化形式，而游离形式才具有诱导和调控作用，培养效果与游离生长素的含量成显著正相关。2，4-D 在进入植物体后，能够持续地以游离形式存在，与氨基酸的结合量很少。但 IAA 进入细胞后大多与氨基酸结合形成复合物，游离形式很少。NAA 则介于二者之间(表)。因此，不同生长素可能具有不同的作用方式。近年来的研究还证明，植物激素对生长发育的调控是通过复杂的信号转导途径实现的，不同的生长素均具有各自独立的生长素受体。这些研究指出，尽管不同生长素在离体培养中具有类似的作用，但它们调控细胞生长与分化的途径和方式可能存在较大差异对于各种生长素作用方式和调控途径的深入了解，将对离体培养中器官分化的有效调控具有重要意义。2. 简述体细胞无性系诱变的方法及突变体筛选方法。答：1.离体细胞无性系诱变的方法离体培养的诱变包括物理诱变、化学诱变及理化诱变与压力选择相结合等方法。近- 1 - 年来，转座子插入也成为体细胞突变诱导中一种新的诱变策略。 （1）物理诱变 物理诱变主要是通过射线、磁场及温度等对培养物进行一定处理，然后对处理后的培养物进行培养筛选。常用的射线处理包括 x 射线、γ 射线、快中子和紫外线等。选择辐射类型应根据培养类型进行。如果以组织器官为诱导材料，可以选择辐射强度较大的 γ线、快中子等进行辐射。如果是细胞或原生质体，则可以选择 x 线、紫外线等。特别是以原生质体为诱导材料时，可以使用紫外线照射，因为常用紫外线的波长为 270 nm，与 DNA 吸收波长 260 nm 相近，而原生质体因为没有细胞壁的屏障，对紫外线的敏感性较强，从而可以达到较好的诱变效果。此外，紫外线辐射无须特殊设备、无菌环境容易控制，对于一些原生质体培养体系成熟的植物来说，是一种经济有效的诱变方法（2）化学诱变 化学诱变是通过在培养基中添加一些化学物质，细胞对这些化学物质吸收后直接或间接引起碱基突变。常用的化学诱变剂主要有：烷化剂(硫酸二乙酯 DES，乙基磺酸乙酯EES，甲基黄酸乙酯 EMS，环氧乙烷 EO 和乙烯亚胺 EI 等)，此类诱变剂有一个或多个活化烷基，可与 DNA 分子中的碱基或磷酸基结合，改变 DNA 的结构而引起突变。（3）复合因子诱变 诱变处理可以是单因子处理，也可以是复合因子诱变。一般来说，复合诱变的效果比单因子诱变好。复合诱变处理的方法有：两种或两种以上的诱变剂同时使用或交替使用，同一种诱变剂连续重复使用等。（4）转座子插入诱变 转座子插入诱变是近年来利用分子生物学技术发展起来的新的体细胞变异诱导方法。转座子既可直接将外源基因带人细胞内获得新性状，又可以独立插入通过其转座功能诱导变异。目前，使用较多的转座子体系主要是玉米的 Ac／Ds 系统，其主要操作过程是，首先采用基因转化的方法将 Ac／Ds 导入受体细胞，再通过体细胞培养或再生植株的自交或测交使 Ac 因子切除，由于转座子插入的随机性，即可在切除 Ac 的植株中筛选出不同变异。2.体细胞突变体的筛选 尽管离体诱变的频率相对较高，然而真正能够利用的目的变异却很少。因此，利用- 2 - 有效技术进行突变的分离和筛选，是获得目的变异的必需步骤。突变筛选的方法主要是根据拟分离的突变性状特性来决定和设计的。根据筛选时所采用的策略，筛选方法可分为两类：直接筛选法和间接筛选法。（1）直接筛选法 直接筛选法是在设计的选择条件下，能使培养细胞或再生个体获得直接感官上的差异，因此能将突变个体和非突变个体分离。最直接的做法是用一种含有特定物质的选择培养基，在此培养基上只有突变细胞能够生长，而非突变细胞不能生长，从而直接筛选出突变体。（2）间接筛选法 间接选择法是一种借助于与突变表型有关的性状作为选择指标的筛选方法。当缺乏直接选择表型指标或直接选择条件对细胞生长不利时，可考虑采用间接筛选法。例如，脯氨酸(Pro)作为一种渗透调节物质，在维持细胞膜稳定性、细胞水分平衡等方面具有重要的生物学意义。3. 简述超低温保存的概念及常用的超低温保存方法。答：超低温保存指-80℃以下低温下，活细胞的物质代谢和生命活动几乎完全停止，而恢复到常温后，植物仍能进行正常的生命活动的离体保存方式。常用保存方法：冷冻诱导保护性脱水的超低温保存和玻璃化处理的超低温保存。4. 简述体细胞杂交中杂种细胞的选择方法，及杂种植株的鉴定方法。答：体细胞杂交中杂种细胞的选择方法有：（1）互补选择法：两个具有不同生理或遗传特性的亲本，在形成杂种细胞时能产生互补作用，根据这一特性进行杂种细胞选择的方法称为互补选择法。① 激素自养型互补选择；②叶绿体缺失互补选择；③营养缺陷型互补选择；④抗性互补选择；⑤抗光性互补选择。（2）机械选择法：利用两种原生质体的某些可见标志，如形态色泽上的差异等对融合产物进行鉴别，在其可辨特征消失之前，将融合的细胞从混合群体中挑选出来进行单独培养，这一方法称为机械选择法。① 利用天然颜色标记分离杂种细胞；②利用荧光素标记分离杂种细胞；③应用荧光- 3 - 激活细胞分选仪自动分离杂种细胞；④应用流式细胞仪分离杂种细胞。（3）组织培养筛选法：植物细胞对培养基成分和培养条件的要求与反应不同也可作为选择杂种细胞的依据。因此，可以利用这种特性，或人为地造成杂种细胞生长和分化能力的差异进行杂种细胞的选择。研究发现，融合细胞与未融合细胞对组织培养的反应不同，主张用组织培养筛选法结合形态学观察去鉴别和筛选杂种。杂种植株的鉴定方法有：（1）形态学鉴定；（2）细胞学鉴定；（3）生化分析；（4）分子生物学方法。6. 简述动物细胞培养技术的原理、方法和应用价值。答：动物细胞培养就是从动物机体内取出相关的组织，将它分散成单个细胞，然后，放在适宜的培养基中，让这些细胞生长和增殖。动物细胞培养通常选择动物胚胎或幼龄动物的组织、器官，它们细胞增殖能力强，分裂旺盛，分化程度低，容易培养。在进行动物细胞培养时，用胰蛋白酶分散细胞，说明细胞间的物质主要是蛋白质。动物细胞培养适宜的 PH 为 7.2—7.4，此环境下胃蛋白酶（2.0）没有活性，而胰蛋白酶(7.2-8.4)的活性较高。通常使用液体悬浮培养。动物细胞培养条件在无菌、无毒的环境；培养基营养含有葡萄糖、氨基酸、无机盐、维生素、 动物 血清等（ 添加一定 量的 抗生素， 定期更换培养液）；温度在 36.5+（-）0.5 度；气体环境有 O2 和 CO2（95%空气和 5% CO2 ）。动物细胞培养技术的应用主要：（1）生产蛋白生物制品：病毒疫苗、干扰素、单克隆抗体等。（2）获得大量自身的皮肤细胞，用于植皮。（3）用于检测有毒物质。（4）用于生理、病理、药理等方面的研究，为治疗和预防疾病提供理论依据。7. 建立细胞悬浮培养体系有哪些关键环节？如何调控？答：建立细胞悬浮培养体系，一般采用愈伤组织作为起始细胞来源，以愈伤组织为起始细胞的悬浮培养技术，其关键主要包括愈伤组织诱导、悬浮系的建立与继代培养、细胞生长状态调控等几个环节。① 愈伤组织诱导以愈伤组织作为细胞悬浮培养的细胞来源，首先就必须诱导出适宜的愈伤组织。诱导愈伤组织，首先必须选择适宜的植物外植体材料其次，培养基的附加成分对建立疏松- 4 - 易散的愈伤组织具有较大的影响，特别是生长素的浓度至关重要。除了生长素外，配合一定浓度的细胞分裂素也是十分必要的。还需附加一定浓度的水解酪蛋白、脯氨酸、谷氨酰胺等有机物质。培养基的蔗糖浓度也会影响愈伤组织的形态。在继代培养中不断选择那些疏松性好、细胞状态好的细胞不断继代培养，才能获得大量均匀一致、疏松易碎、适合于建立悬浮细胞系的愈伤组织。另外，缩短继代培养的时间间隔，可以有效提高疏松愈伤组织的诱导率。② 悬浮系的建立与继代培养在培养初期，悬浮细胞培养物可能呈现黏稠状，影响细胞生长，因此每隔 3 天左右要更换一次新鲜培养基。连续继代培养一段时间后，这种情况可自行消失。为了保持悬浮细胞一直处于一个相对稳定的良好状态，一般每隔 1～2 周甚至更短的时间就要继代一次。每次继代时均要进行选择，筛选细胞生活力好的细胞继代，淘汰过大和生理状态不好的细胞和细胞团。筛选方法一般采用蔗糖梯度离心法，有时为了简便也可采用过滤法。③ 悬浮细胞的生长动态悬浮培养系统中，细胞数量随着培养时间的变化，其扩增生长呈 S 形曲线。在细胞接种最初的时间内细胞很少分裂，经过一个延迟期(lagphase)，然后进入指数生长期(exponential growth phase)和细胞迅速增殖的直线生长期(linear growth phase)，接着是细胞增殖减慢的减缓期(progressive decelerational phase)和停止生长的静止期(stationary phase )。静止期的细胞数量和质量均会下降，如果继代不及时，长期处于停止期的细胞往往会出现死亡和生活力下降，从而影响整个悬浮细胞系的状态。因此在通常情况下，当细胞生长进入减缓期时就要及时继代。接种初期的细胞密度过低往往使延迟期加长，因此，根据培养目的的不同，悬浮细胞的起始密度一般可在每毫升(0.5-2.5)×105 个细胞间进行调整。如果只是一般继代培养，则可适当选择低密度接种，以延长培养周期，减少继代培养的操作。但如果希望在较短时间内获得大量活跃生长的细胞，则可适当提高接种密度，这样可缩短继代培养时间。起始密度通常通过细胞计数的方法确定。- 5 - 二、论述题（请选择 1 道题作答，共 16 分）1. 现有小鼠及其骨髓瘤细胞、破伤风杆菌抗原，设计一个实验无限生产破伤风杆菌单克隆抗体，并说明实验中使用的技术的应用价值及意义。答：主要是单克隆抗体的实验设计：通过对小鼠注射破伤风杆菌抗原，从小鼠的脾脏中取得 B 淋巴细胞，该细胞能够产生化学性质单一、特异性强的破伤风杆菌抗体；再把获得的淋巴细胞和小鼠骨髓瘤细胞融合，通过灭活的仙台病毒作为诱导剂，融合细胞继承了骨髓瘤细胞和淋巴细胞共同的遗传特性，既能产生特异的破伤风杆菌抗体，又能无限增殖细胞。并且通过挑选的杂种细胞继续培养，通过原代培养和传代培养两个阶段其中 50 代以内的的细胞属于细胞株。实验中使用了动物的细胞融合技术和细胞培养技术。动物细胞融合即指通过灭活的仙台病毒黏附于细胞表面，然后细胞膜被病毒颗粒穿通，细胞膜接触后连接，细胞发生融合，并形成杂种细胞，其细胞膜还具有一定的流动性。动物细胞培养就是从动物机体内取出相关的组织，将它分散成单个细胞，然后，放在适宜的培养基中，让这些细胞生长和增殖。细胞融合的价值和意义是：①在基础理论研究中具有重要意义；②在疾病诊断、治疗和预防方面，具有特异性高、灵敏度高等优越性③作为载体，运载抗癌药物，制成生物导弹。动物细胞培养技术的应用价值和意义主要表现在：①生产蛋白生物制品：病毒疫苗、干扰素、单克隆抗体等；②获得大量自身的皮肤细胞，用于植皮；③用于检测有毒物质；④用于生理、病理、药理等方面的研究，为治疗和预防疾病提供理论依据。2. 如果有一品质和产量不好的植物，希望通过转基因的方法转入能改良其品质和产量的基因，请根据细胞工程中农杆菌介导的方法阐述其转基因的原理、方法、步骤及可能出现的问题等。答：可以通过转基因方法（农杆菌介导的方法）转入改良品质和产量的基因，整合表达，获得具优良品质和高产的转基因植株。农杆菌介导法原理：构建带有目的基因的载体，转入农杆菌，利用农杆菌的毒性，侵染植株，使目的基因进入植株细胞内，与核基因进行遗传物质重组，并获得性状表达。方法：组织培养、农杆菌介导法（遗传转化）。- 6 - 实验步骤：（1）构建载体，转入筛选好的农杆菌，同时做农杆菌敏感试验；（2）遗传转化：外植体预培养，农杆菌侵染，共培养，筛选培养，分化培养，生根培养，移栽；（3）鉴定及基因功能表达的观察等。 可能出现的问题：（1）转化频率低，周期太长；（2）基因沉默，没有表达；（3）功能表达很低，需要细微的比较检测。- 7 -