西南大学网络与继续教育学院课程考试试题卷类别： 网教 (网教/成教) 专业： 农学 课程名称【编号】：细胞工程【1117】 A 卷大作业 满分：100 分一、问答题（84 分）（请选择 6 道题作答，14 分/题，共 84 分）2.简述植物离体培养的环境条件的调控及其对培养的影响。答：植物在离体培养条件下，由于脱离了母体组织，因而外植体本身必须发生一系列的生理生化变化才能适应离体环境。另一方面，作为离体培养的环境条件，特别是培养基，也必须符合外植体生长的需要。由此可见，影响离体培养细胞遗传变异的因子必然包括外植体本身及其培养条件。1．供体植物供体植物的遗传背景对体细胞变异具有直接影响。Sacristan(1971)的研究指出，供体植株原有的倍性水平在培养细胞多倍化过程中起着重要作用。他比较了长期培养的还阳参单倍体细胞系和二倍体细胞系发生的细胞学变化，结果发现，单倍体组织的二倍化现象比二倍体组织的四倍化现象更为常见，这表明在培养中处于二倍体水平上的细胞比处于单倍体水平上的细胞较为稳定。2.培养基及培养方式离体培养再生植株的过程是一系列培养因子和环境的调控过程，这些培养条件对体细胞变异产生着不同程度的影响。普遍认为，培养方式、激素及其他附加成分均会诱导体细胞变异的发生，因为离体培养本身可能就是一种变异诱导的过程。尽管如此，有关培养基成分及培养条件对体细胞变异影响的研究却并不多。3.继代培养的次数由继代次数引起的体细胞变异几乎在各种类型的植物中均有报道。一般来讲，继代时间越长，继代次数越多，细胞变异的概率就越高。3.简述原生质体杂交中，杂种细胞的几种选择方法及其鉴定方法。答：一、杂种细胞的选择方法：1、互补选择法：⑴激素自养型互补选择；⑵叶绿体缺失互补选择；⑶营养缺陷型互补选择；⑷抗性互补选择；⑸抗光性互补选择。2、机械选择法：⑴利用天然颜色标记分离杂种细胞；⑵利用荧光素标记分离杂种细胞；⑶应用荧光激活细胞分选仪自动分离杂种细胞；3、组织培养筛选法：植物细胞对培养基成分和培养条件的要求与反应不同也可以作为选择杂种细胞的依据。可以利用这种特性或人为地造成杂种细胞生长和分化能力的差异进行杂种细胞的选择。二、杂种植株鉴定方法的应用1、形态学鉴定：根据双亲的形态学性状观察进行鉴定。2、细胞学鉴定：细胞器鉴定、染色体鉴定。3、生化分析：同工酶分析，体细胞杂种的同工酶谱可表现为双亲酶带的总和，或同时出现双亲特有的谱带，或者也有可能出现新的杂种带和丢失部分亲本带； 4、分子生物学方法：RFLP 鉴定、RAPD 标记鉴定。4.简述影响植物基因转化频率的因素及调控措施。答：（一）高频再生系统的建立 由于遗传转化中外源基因整合的频率限制，要求用于遗传转化的受体系统必须具有高频率再生植株的能力。一个高频再生系统必须具有 3 个条件：①外植体的组织细胞良好的培养反应，且具有高频率再生完整植株的能力；②培养方法相对简单，具有高度可重复性；③体细胞无性系变异小。所有培养体系研究的例证显示，高频再生体系是植物材料本身的遗传基础、生理状态与培养基、培养条件协调匹配的结果。 1、植物材料的选择 同类植物不同基因型、同一基因型不同组织器官，甚至同一组织器官不同部位的外植体细胞，其接受外源基因的能力也有明显差异。所以，要建立高效的基因转化体系，首先要选择具有接受外源基因潜在能力的植物细胞类型。 （1）外植体的遗传背景 受体基因型的选择通常首先考虑的是需要改良的目标性状。然而，大量的试验显示，许多欲改良的植物品种或类型，其高频再生系统的建立往往十分困难，这一现象也是目前困扰基因工程育种的问题。一些培养困难的基因型研究显示，除个别玩拗性基因型外，大多数在一般条件下培养困难的基因型经过培养条件的改良仍然可以取得较好的培养效果。因此，在基因工程研究中，应该注重筛选一些具有广谱应用范围的培养技术，以适于不同基因型的培养，使遗传转化实现真正的定向改良。但在目前的情况下，为保证遗传转化的成功，转化前筛选培养反应良好、对转化条件敏感、易于接受外源基因的基因型仍然是必要的。 （2）外植体生理状态 外植体的生理状态与其分生能力有着直接的关系。代谢活跃、休眠萌动的细胞具有更强的生长潜能，有利于培养成功。取自母体植物生长旺盛但不徒长的相应外植体，通常细胞充实，对离体操作的忍耐性强，细胞全能性表达能力强。因而更容易建立高效再生的受体系统。任何植物的发育过程都要经过幼年型及成年型两个阶段。由于植物发育是处于一个连续的统一系统中，因此，同一个植株个体有些组织器官是幼年型，有些是成年型，同一组织器官的不同部位也存在差异。幼年型和成年型的外植体在形态解剖结构及细胞生物学等方面均存在着很大差别，特别是对诱导条件的反应能力、接受外来物质的状态差异十分显著。选择生理上相对年轻的外植体类型建立受体系统，不仅可提高培养效率，同时也可保证较高的转化率。 此外，生理年龄小的外植体本身，其细胞群体常常具有较好的遗传一致性和稳定性。因而，选择这类外植体建立的受体系统，也可相对降低体细胞变异频率，保证体系的遗传稳定性。 （3）外植体的选择与受体系统类型的匹配 外植体的选择除了考虑以上问题外，还应注意与相应的受体系统匹配。由于不同的再生系统通常对外植体具有一定的特殊要求，因而，外植体选择时考虑的侧重点是不同的。此外，有些受体系统通常采用二次培养的产物为外植体，其初期培养的外植体对以后的体系影响也较大。如原生质体系统，其原生质体来源可以是无菌叶片，也可以是悬浮培养细胞，还可以是性细胞原生质体，三者分离的原生质体在生理状态上有很大差异，这些差异除了后期培养条件的影响外，还与初期培养时的外植体有关。特别是悬浮培养细胞，选择胚为外植体建立的悬浮系和选择营养组织细胞建立的悬浮系，其细胞状态和分化能力通常有较大差异，前者表现出在增殖和分化两个方面均具优势，而后者在分化上的调控往往比较困难。外植体选择时，必须充分考虑这一点。 2、培养基及培养条件 - 1 - 培养基是离体培养中外植体生长发育的营养环境。植物种类不同，需要的营养条件通常有一定差异。在建立某一植物受体系统之前，需根据该植物对营养条件的需求选择相应的培养基。 在基本培养基确定以后，培养基附加成分特别是激素的筛选往往是受体系统建立初期的重点工作。在组织培养中，生长素和细胞分裂素是目前使用最为广泛的两类激素。生长素的主要功能是诱导启动细胞分裂、促进愈伤组织形成和生根等。目前常用的生长素主要有 2，4-D、NAA、IBA 和 IAA，此外，2，4，5-T、NAA 在有些实验中也有使用。其中 IAA 和 IBA 主要用于生根，IAA 还能与细胞分裂素互作促进芽的增殖。2，4-D、2，4，5-T、NAA 则多用于愈伤组织的诱导和生长。 不同植物对细胞分裂素与生长素种类的敏感性不同，因此激素种类的选择应以植物种类而定。同一植物的不同组织在愈伤组织诱导和芽分化过程中对激素浓度的要求也不相同，所要求的水平取决于细胞内源激素的水平，即使是同一植物也很难有完全相同的激素配比。激素的应用还与受体系统的类型有关，对于不同的受体系统而言，激素的使用浓度和配比具有很大差异。所以，离体培养体系建立的初期，必须根据外植体情况对激素配比浓度进行实验筛选。 （二）抗生素敏感性 植物转基因中通常有两种目的要使用抗生素，一是抑制农杆菌生长，二是筛选转化细胞。抗生素通常对细胞的生长具有抑制和毒害作用，但对植物细胞而言，这种抑制和毒性的程度在不同抗生素间具有一定差异。因此，在受体系统建立时，需要对相关的抗生素种类及其使用浓度进行实验筛选。由于抗生素的使用浓度通常与一定的植物细胞对抗生素的敏感程度有关，所以，一般将这种针对抗生素筛选的实验称之为抗生素敏感性实验。 对于抑制农杆菌生长的抗生素实验而言，其抗生素种类和浓度的筛选要考虑植物种类和农杆菌株系两个方面的因素。通常要求使用的抗生素是对植物细胞无毒，不显著抑制植物细胞生长的类型。使用较多的是 β-内酰胺类抗生素，如氨卞青霉素(ampicillin)和羧卞青霉素(carbenicillin)。头孢霉素因其对植物细胞毒性小，且具有广谱抗性，因此近年来被广泛用于转化实验中。关于抗生素的使用浓度，需要根据植物材料和农杆菌株系进行试验确定。总体来讲，以能够有效抑制农杆菌生长而不妨碍植物细胞生长的浓度为宜。 用于转化子筛选的抗生素，是根据转化载体上携带的抗生素标记基因确定的。因此，抗生素试验主要是确定适宜的使用浓度。尽管从理论上讲，只有转化获得抗生素基因的细胞才能在含有相应抗生素的选择培养基上生长，但实验证明，当选择性抗生素浓度过低时，通常会获得许多假阳性植株，而当抗生素浓度过高时，又会抑制一些真正的转化细胞的生长，降低培养效率。所以确定适当的选择性抗生素浓度是转化系统建立必不可少的实验步骤。 （三）农杆菌敏感性实验 农杆菌介导的基因转化是目前植物基因转化中使用较广、技术较成熟的实验体系。然而，实验植物是否为农杆菌的天然宿主，则是首先要考虑的问题。即使是农杆菌的天然宿主，由于植物的种属不同，甚至是同一物种的不同基因型，或同一基因型的不同器官和组织，对不同农杆菌的敏感性都会有差异。因此，选择对农杆菌敏感性较高的受体植物及适宜的组织细胞类型是成功转化的重要因素。由于目前使用的农杆菌多为改良的 Ti 和 Ri 系统，因此，为便于实验观察，可在进行正式转化实验之前，采用利用野生型农杆菌菌株浸染植物材料，根据结瘤(或发状根)的诱导率、发生时间及生长状态等确定其敏感性，以筛选对农杆菌敏感的材料建立受体系统。5.简述人工种子的优点及其应用答：1）、培养条件可以人为控制 具有省地省工可直接在田间播种等优点。   2）、在人工种子制作中 可加入营养物质、植物生长调节剂、固氮菌、杀虫剂等。 3）、用于制作人工种子的体细胞胚可利用生物反应器大规模培养 大大提高了效率。   4）、一些难以得到天然种子的珍稀植物或脱毒苗、基因工程植株 均可利用人工种子技术加速用于生产。 6.幼胚培养的关键技术及胚的几种发育方式，各有何特点？答：a、胚性发育：幼胚接种到培养基上以后，仍然按照在活体内的发育方式发育，最后形成成熟胚（有时甚至可能类似种子），然后再按种子萌发途径出苗形成完整植株。这种途径发育的幼胚，一般一个幼胚将来发育成一个植株。b、早熟萌发：幼胚接种后，不继续胚性生长，而是在培养基上迅速萌发成幼苗，这种现象即称为早熟萌发。这种方式形成的幼苗往往细弱、畸形，难以成活。因此在幼胚培养中应防止早熟萌发。c、产生愈伤组织：在幼胚培养中常能在追加生长调节剂时诱发愈伤组织产生、进而分化形成胚状体或不定芽。7.简述体细胞无性系诱变的方法及突变体筛选方法。答：1.离体细胞无性系诱变的方法离体培养的诱变包括物理诱变、化学诱变及理化诱变与压力选择相结合等方法。近年来，转座子插入也成为体细胞突变诱导中一种新的诱变策略。 （1）物理诱变 物理诱变主要是通过射线、磁场及温度等对培养物进行一定处理，然后对处理后的培养物进行培养筛选。常用的射线处理包括 x 射线、γ 射线、快中子和紫外线等。选择辐射类型应根据培养类型进行。如果以组织器官为诱导材料，可以选择辐射强度较大的 γ 线、快中子等进行辐射。如果是细胞或原生质体，则可以选择 x 线、紫外线等。特别是以原生质体为诱导材料时，可以使用紫外线照射，因为常用紫外线的波长为 270 nm，与 DNA 吸收波长 260 nm 相近，而原生质体因为没有细胞壁的屏障，对紫外线的敏感性较强，从而可以达到较好的诱变效果。此外，紫外线辐射无须特殊设备、无菌环境容易控制，对于一些原生质体培养体系成熟的植物来说，是一种经济有效的诱变方法（2）化学诱变 化学诱变是通过在培养基中添加一些化学物质，细胞对这些化学物质吸收后直接或间接引起碱基突变。常用的化学诱变剂主要有：烷化剂(硫酸二乙酯 DES，乙基磺酸乙酯 EES，甲基黄酸乙酯 EMS，环氧乙烷 EO 和乙烯亚胺 EI 等)，此类诱变剂有一个或多个活化烷基，可与 DNA 分子中的碱基或磷酸基结合，改变 DNA 的结构而引起突变。（3）复合因子诱变 诱变处理可以是单因子处理，也可以是复合因子诱变。一般来说，复合诱变的效果比单因子诱变好。复合诱变处理的方法有：两种或两种以上的诱变剂同时使用或交替使用，同一种诱变剂连续重复使用等。（4）转座子插入诱变 转座子插入诱变是近年来利用分子生物学技术发展起来的新的体细胞变异诱导方法。转座子既可直接将外源基因带人细胞内获得新性状，又可以独立插入通过其转座功能诱导变异。目前，使用较多的转座子体系主要是玉米的 Ac／Ds 系统，其主要操作过程是，首先采用基因转化的方法将 Ac／Ds 导入受体细胞，再通过体细胞培养或再生植株的自交或测交使 Ac 因子切除，由于转座子插入的随机性，即可在切除 Ac 的植株中筛选出不同变异。2.体细胞突变体的筛选 尽管离体诱变的频率相对较高，然而真正能够利用的目的变异却很少。因此，利用有效技术进行突变- 2 - 的分离和筛选，是获得目的变异的必需步骤。突变筛选的方法主要是根据拟分离的突变性状特性来决定和设计的。根据筛选时所采用的策略，筛选方法可分为两类：直接筛选法和间接筛选法。（1）直接筛选法 直接筛选法是在设计的选择条件下，能使培养细胞或再生个体获得直接感官上的差异，因此能将突变个体和非突变个体分离。最直接的做法是用一种含有特定物质的选择培养基，在此培养基上只有突变细胞能够生长，而非突变细胞不能生长，从而直接筛选出突变体。（2）间接筛选法 间接选择法是一种借助于与突变表型有关的性状作为选择指标的筛选方法。当缺乏直接选择表型指标或直接选择条件对细胞生长不利时，可考虑采用间接筛选法。例如，脯氨酸(Pro)作为一种渗透调节物质，在维持细胞膜稳定性、细胞水分平衡等方面具有重要的生物学意义。二、讨论题（16 分）（请选择 1 道题作答，16 分/题）1. 根据细胞工程的概念及相关知识说明细胞工程在农业、工业、畜牧业及医药等方面的应用答：（一）细胞工程在现代生物技术中的地位及其实践意义1、改善农业生物技术 :培育优良农业新品种，提高粮食产量 ；植物育种的新途径 ；动物改良、性别控制、动物食品等起重要作用 。2、保护自然资源:维护生态平衡 ；代替化学工业，保护生态环境 ；生产天然产物，避免工业污染 。3、生物医药开发 : 单克隆技术生产诊断试剂盒 ； 生产疫苗 。 ；（二）植物细胞工程的应用1、植物育种 （1）快速获得特殊倍性材料 （2）克服远缘杂交不亲和 （3）克服杂种胚早起夭折 （4）导入外源基因 （5）突变体筛选 （6）种质资源保存 2、种苗脱毒与快速繁殖3、细胞培养生产有用次生产物 4、在细胞生物学和发育生物学研究中的应用 5、在植物遗传、生理生化以及植物病理等基础研究中的应用 - 3 -