荷叶生物碱提取与纯化摘要本研究为获得更多地荷叶生物碱盐，将荷叶生物碱盐的提取率作为其重要指标，选择了最为常用的加热回流法进行了试验，通过单因素试验考察提取时间、提取功率、温度、料液比等因素对总生物碱盐提取得率的影响，以确定荷叶总生物碱提取分离的最佳工艺条件。结果表明，乙醇是荷叶生物碱最佳的提取试剂，90℃是荷叶生物碱的最佳提取温度，120 min 是荷叶生物碱的最佳提取时间以及 1：15 是荷叶生物碱的最佳提取料液比。关键词 荷叶 生物碱 提取 纯化I 浙江大学远程教育学院本科毕业论文（设计） 第 3 章 结果与分析提取溶剂种类 荷叶生物碱提取量（mg/mL） 荷叶生物碱提取率（%）蒸馏水 19.318 75.120.25%稀硫酸 20.389 82.1075%甲醇 18.584 76.88乙醚 18.145 72.0290%乙醇 20.421 81.39氯仿 15.224 60.13提取温度对提取率的影响以 100 mL 90% 乙 醇 为 提 取 溶 剂 ， 分 别 测 定 经10℃、20℃、30℃、40℃、50℃、60℃ 、70℃、80℃、90℃、100℃十个不同温度条件下提取的荷叶总生物碱含量 2 h，并计算其总生物碱提取率，分析数据发现，温度越高，荷叶总生物碱提取率越高，但在 90℃与 100℃时，其提取率相差不大，考虑到节能，本实验将 90℃作为荷叶生物碱的最佳提取温度。图 3-1 提取温度对荷叶生物碱的提取率影响提取时间对提取率的影响以 100 mL 90% 乙 醇 为提 取 溶剂 ， 即 料 液 比 为 1 ： 20 ，分 别测 定经 20min、40min、60 min、80 min、100 min、120 min、140 min 七个提取时间提取的荷叶总生物碱含量，并计算其总生物碱提取率，分析数据发现，提取时间越长，荷叶总生物碱提取率越高，但在 120 min 后，其提取率增加幅度逐渐减少，甚至出现平台期现象。因此，本实验将 120 min 作为荷叶生物碱的最佳提取时9 浙江大学远程教育学院本科毕业论文（设计） 第 3 章 结果与分析间。图 3-1 提取时间对荷叶生物碱的提取率影响料液比及提取次数的选择分别测定经 1：5、1：10、1：15、1：20 四个不同水平料液比提取的荷叶总生物碱含量，并计算其总生物碱提取率，分析数据发现，料液比越大，荷叶总生物碱提取率越高，当料液比为 1：15 时，经第一次提取，荷叶生物碱提取率达至 80.12%，待第二次提取后，其提取率上升至 95.73%；而当料液比大于1：15 时，荷叶生物碱的提取率则变化不明显。因此，本实验将 1：15 作为荷叶生物碱的最佳提取料液比。表 3-2 料液比与不同提取次数对荷叶生物碱提取率的影响料液比 提取次数（次）荷叶生物碱提取量（mg/mL）提取率（%）1：5 1 7.075 64.192 9.921 75.063 8.456 78.411：10 1 9.466 76.422 10.504 85.573 9.411 89.941：15 1 20.503 78.322 5.208 95.733 5.107 98.201：20 1 5.243 89.472 5.343 97.9010 浙江大学远程教育学院本科毕业论文（设计） 第 3 章 结果与分析3 5.185 99.3111 浙江大学远程教育学院本科毕业论文（设计） 第 4 章 小结与讨论第4章 小结与讨论本文以提取得率为指标，为了尽可能多的提取荷叶生物碱盐，选择了加热回流法进行了试验，通过单因素试验考察提取时间、提取功率、温度、料液比等因素对总生物碱盐提取得率的影响，以确定荷叶总生物碱提取分离的最佳工艺条件。结果表明，乙醇是荷叶生物碱最佳的提取试剂，90℃是荷叶生物碱的最佳提取温度，120 min 是荷叶生物碱的最佳提取时间以及 1：15 是荷叶生物碱的最佳提取料液比。尽管本实验确定了荷叶生物碱最佳的提取试剂、提取温度、提取时间、提取料液比，但都是通过单因素实验进行考察的。荷叶生物碱的提取率受多种因素的影响，且各个因素之间还可能存在相互影响的现象。因而，为得到更为优化的荷叶生物碱提取工艺条件，最好将各个因素综合起来设计成多因素正交实验，从而获得更为准确的实验数据。本部分实验，将在后续工作中进行。当然在此过程中也发现，利用加热回流法得到的荷叶碱对应的吸光度值较低，在以后的研究中，可以选择将荷叶中的荷叶碱先进行浓缩后，后再进行测定。此外本实验仅讨论了提取试剂类型对荷叶碱的提取率影响，得到 90%乙醇是荷叶生物碱最佳的提取试剂，在后续的研究过程中，可进一步探究不同浓度下的乙醇作为荷叶生物碱提取试剂对于其提取率的影响。高血脂主要以体内积聚过多脂肪为特征，是一种在全球范围内广泛流行的慢性疾病。在临床上，高血脂也是高血压、糖尿病以及其他各种心脑血管疾病的主要形成因素之一，对于人们的生活造成了严重的影响。因而寻找到能够有效降低血脂的药物成为了整个医学界的共同愿望之一。《本草纲目》中记载，荷叶具有抗衰老、抗菌、消除炎症等功效。此外也有其他报道发现，荷叶具有其他多生物学功能，如目前，已有研究证明荷叶具有良好的减肥降脂作用，极具较大的市场开发价值。赵骏[10]等在醇提荷叶生物碱与酸水提生物碱盐时发现，相比于生物碱组，生物碱盐组对于血脂水平具有显著的抑制作用，而高莹[12]等测量 SD 大鼠与 Wistar 大鼠面对高脂饲料的反应时发现，SD 大鼠是潜在的高血脂模型。但对于荷叶为何能减肥降脂这一问题还未得到很好地解释，其背后的分子机制仍有待探讨。越来越多的医学实验数据表明，人体内抗氧化反应产生的自由基与人体的衰老以及多种疾病均有关系。抑制自由基产生、清除从而将其参与的过氧化反应抑制住即为抗氧化活性物质的主要原理。由于抗氧化物质能够阻碍自由基的侵袭，从而减弱发生癌症、冠心病以及其他一些老年疾病的可能性，而备受国内外众多学者的关注。目前认为，将植物作为抗氧化物质获取的来源，是一种12 浙江大学远程教育学院本科毕业论文（设计） 第 4 章 小结与讨论较为健康有效的途径，事实证明，已有多种植物中提取分离出抗氧化物质。而荷叶，由于其具有抗氧化的生物学功能，也广受关注。已有研究表明，荷叶提取液具有较强的超氧阴离子自由基与羟基自由基的清除能力，但也有报道认为尽管荷叶具有清除自由基的能力，但不同的提取溶剂会导致其体外抗氧化活性存有差异。尽管荷叶中包含多种不同的生物碱，也有较多报道成功将荷叶总生物碱分离出来，但对于荷叶生物碱中有效活性成分的分离提纯，以及各个生物碱单体的提纯与其背后的药理机制仍是大片空白，报道较少，有待进一步深入挖掘；目前，对于荷叶的应用多以复方的形式进行，而其相应的毒副作用却未见报道而将荷叶及其相关成分入药，对其毒副作用的观察必不可少，因此此部分空白需加以填补，尤其是服用荷叶及其相关成分带来的长期毒性以及不良反应的毒理学以及药效学研究。目前，市场上关于荷叶的产品多为粗提粗加工，未来的方向，应将荷叶及其相关产品的加工提取向精制与深加工等方面转化，由于荷叶的成分较为复杂，在研究的过程中，可能需要应用多个学科，多种途径，通力合作，进行系统性地开发研究，从而开发制备出低毒高效的荷叶保健品与药品。13 浙江大学远程教育学院本科毕业论文（设计） 参考文献参考文献[1] 刘成梅, 游海. 天然产物有效成分的分离与应用[M]. 化学工业出版社,2003.[2] 刘淑萍. 荷叶中生物碱的制备及其药理学活性研究[D]. 石家庄:河北医科大学, 2004.[3] 朱秀萍, 徐翔. 野生物件研究进展[J]. 中国药房, 2008, 19(6):459-460.[4] 黎先才, 李萍, 李静. 水热改性 SO42- /ZrO2 催化剂的制备及其对酯化反应的催化性能[J]. 精细化工, 2006, 23(2): 33-135.[5] Song X, SayariA. 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W.Serturner 首次将吗啡碱（morphine）从鸦片中分离出来。后来，众多的生物碱被分离出来。迄今为止，已有一万余种生物碱从自然界分离出来。目前，在植物界一百余科植物中均发现有生物碱的存在，其中双子叶植物发现的数量最多其次是单子叶植物、裸子植物以及蕨类植物。但尚未发现苔藓类与地衣类植物中含有生物碱。此外还发现，生物碱也存在于加拿大海狸、一些昆虫、蟾蜍以及蛙类等动物体内，部分也存在于少数真菌中。就生物碱含量而言，罂粟科、茄科、豆科、菊科、小檗科、毛莨科、防已科、马钱科、石蒜科、百合科以及夹竹桃科等植物中均较多。其中，还发现生物碱甚至存在于罂粟科等一些科中全科植物中。但生物碱在天然药物中的含量大多较低，往往小于百分之一，甚至有些特别低，比如长春新碱在长春花中仅占有百万分之一的含量，而美登木素在美登木中甚至只有千万分之一的含量。而小檗碱在黄连中的含量可以达至百分之九，奎宁在金鸡纳皮中的含量甚至能够高达百分之十五。作为一类重要的生药有效成分，目前分离到的一万余种生物碱中的八十余种已经应用临床实践中，如小檗碱(berberine)从黄连中分离出来，以发挥抗菌消炎的功效；麻黄碱(ephedrine)从麻黄中分离出来，以用来平息哮喘；利血平(reserpine) 从萝芙木中分离出来，以用来降低血压；利血平(reserpine) 从萝芙木中分离出来，以用来降低血压；喜树碱(camptothecine)与长春新碱(vincristine)分别从喜树与长春花中分离出来，以治疗肿瘤。因而，目前提取并利用生物碱成分，开发新药成为了药品研发的研究热点之一[2]。由于一些研究发现生物碱能够抵御病毒，治疗肿瘤，目前临床上已广泛应用了多种生物碱制药品，比如长春新碱由于其抗癌作用而成为抗癌药物的主要成分，吗啡由于其镇痛效果而成为镇痛片的主要成分，麻黄碱由于能够缓解哮喘而成为抗哮喘药物的主要成分[3]。荷叶，即为从睡莲属植物莲采摘下来的叶片，全世界范围内均有广泛分布 。已发现，荷叶含有多重有效活性物质，因而在实践应用中，荷叶不仅是食品的2 浙江大学远程教育学院本科毕业论文（设计） 第 1 章 引言来源，而且还是用于制备药品的天然植物原[4]。随着人们生活水平的提高，肥胖及高血脂成为现代人的一大烦恼，因此降脂减肥的产品有了很大的市场[5]。现代药理学领域的相关研究表明，来源于荷叶中的生物碱与黄酮是荷叶的主要有效成份，能够抑制细菌，抗氧化，解除痉挛，减低人体的血脂水平，抑制胆固醇的生成，抵抗细胞有丝分裂过程[6]。杜力军等[7]成功建立了急性高脂血症小鼠整体模型，以观察荷叶水提物对于动物体内血清胆固醇与甘油三酯水平的影响。结果表明，荷叶水提物能够显著降低动物体内的脂肪水平，并且荷叶黄酮是其主要活性部位，而荷叶生物碱占第二位。徐剑[8]等发现荷叶作为复方冲剂成分时，能够显著抑制家兔高脂血症中的血清甘油三脂与血清总胆固醇的水平从而抑制脂质在动物组织中的沉淀，以及预防动物血管发生动脉粥样硬化。钱彦方[9]等研发的轻健胶囊由于能够促进动物脂肪细胞的代谢，抑制甘油三酯在脂肪细胞中的合成过程以及脂肪细胞对于脂肪酸的吸收，加速游离脂肪酸向周围血液中释放出来以及甘油三酯的酶性水解，从而有效降低了胆固醇与甘油三酯在血液中的浓度，以有效缓解肥胖大鼠体重的增加幅度。此外，轻健胶囊还能将动物的血液粘稠度降低，使红细胞的电泳运动得到提高。这些年来，荷叶主要分为五大类以进入药物中作为制剂：其一，暑热感冒颗粒等一些祛暑清热药；其二，荷叶丸等一些止血药；其三，通便消痤胶囊等一些清热消痤药；其四，血脂宁、荷丹片、通脉降脂片、脂脉康胶囊等一些化湿降脂药；其五，醒脾胃颗粒等一些健胃消食药。由于生物碱在一般植物内能够作为功能药用成分的含量非常小，加之在生物碱提取、纯化等过程均会有部分有效成分损失。然而，生物碱作为中草药等药用成分进行制备，均要求其较高的纯度。而尽全力从植物中提取出可以作为功能药用的有效成分，去除其中的杂质以及有毒成分，对于中草药应用于临床上的治疗效果至关重要。因此，越发多的学者都将注意力转移至研究如何从自然界中高产而有效地得到生物碱，为此而探究创造了很多提取天然产物以及鉴定的实验方法。迄今为止，已有十余种荷叶生物碱被发现，且其大多的化学结构已被确认，但这些生物碱的碱性都不强，较难溶于水，但可以溶解于一些有机溶剂，如甲醇、乙醇、乙醚以及氯仿中，此外这些生物碱还能溶于酸性物质中，一些可溶性的盐在此过程中生成出来。为了进一步提高荷叶生物碱的提取率，其提纯工艺在研究的过程中也被众多的学者进行了优化。赵俊等[10]分析了溶解种类与溶媒浓度这两个溶剂因素对荷叶生物碱提取率的影响。结果发现，加热回流法提取荷叶生物碱时， 95%的乙醇是其最佳试剂，而超声提取时 ，0.5%盐酸是其最佳试剂，而大孔吸附树脂是最佳的荷叶生物碱纯化工艺。肖文军等[11]分析比价了 HP-20、D101 以及聚酰胺这三种树脂在荷叶生物碱提取与纯3 浙江大学远程教育学院本科毕业论文（设计） 第 1 章 引言化过程中的差异，其中分离纯化效果最好的是 D101 树脂。传统意义上，提取荷叶生物碱盐的方法有浸提法与浸渍法等，而新型开发出来的荷叶生物碱盐提取方法有双水相萃取技术、超临界萃取法以及微波辅助提取法等。其中由于加热回流法最为常用，操作简便，且没有有机试剂残留等问题，故而本研究为获得更多地荷叶生物碱盐，将荷叶生物碱盐的提取率作为其重要指标，选择了最为常用的加热回流法进行了试验，通过单因素试验考察提取时间、提取功率、温度、料液比等因素对总生物碱盐提取得率的影响，以确定荷叶总生物碱提取分离的最佳工艺条件。4 浙江大学远程教育学院本科毕业论文（设计） 第 2 章 材料与方法第2章 材料与方法2.1 材料与试剂从衢州市药材市场购得新鲜荷叶作为本实验的原材料。在室温下，将新鲜荷叶浸泡于含有 0.1% NaCl 的磷酸水溶液中 3 min，后用鼓风机烘干至含水率在百分之八以下，经粉碎机粉碎后过 80 目筛，后置于洁净的塑料袋中，并密封于干燥的泡沫箱内，保存于 4℃冷库中备用。荷叶碱标准品购自中国生物检定所。本实验中所用三氯甲烷、磷酸、氢氧化钠、盐酸以及氯化钠均为分析纯级。溴甲酚绿缓冲液的配制：精确称取溴甲酚绿粉末 125 mg，溶解于 2.5 mL氢氧化钠溶液中（浓度：0.2 mol/L），后加入邻苯二甲酸氢钾 2.55g，定容至250 mL，不足用蒸馏水补足，并将该溶液 pH 值调至 4.42。2.2 仪器旋转蒸发器（型号：RE-52AAA）购自上海嘉鹏科技有限公司。循环水多用真空泵（型号：SHB-IIIA）购自上海预康科教仪器设备有限公司。紫外分光光度计（型号：UV2100）购自上海尤尼柯仪器有限公司。恒温水浴锅（型号：HH-4）购自国华电器有限公司。酸度计（型号：PHS-25）购自上海精密科学仪器有限公司。食品粉碎机（型号：878-A）购自金坛市科析仪器有限公司。电子分析天平（型号：FA2004）购自上海牧晨电子技术有限公司。2.3 荷叶生物碱的提取称取荷叶粉末 5 g 并放置于圆底烧瓶内，加入适量的酸溶液，后与 40 厘米的冷凝管互相连接，进行冷凝回流，以提取荷叶粉末中的生物碱。滴加 0.5%盐酸调节该提取液 pH 值至 2.5 左右，经滤纸滤过后，利用三氯甲烷萃取滤液，后将三氯甲烷层弃去，滴加 0.5% 氢氧化钠数滴将该萃取液 pH 值调节至 7 左右，稍稍静置后，经滤纸滤过。再次滴加 0.5% 氢氧化钠数滴将该萃取液 pH 值调节至 10 左右，再次用三氯甲烷萃取该滤液。将滤液放置于旋转蒸发仪中蒸发完全后，加入 2.5 mL 三氯甲烷，置于超声清洗器上洗脱，即制备得荷叶生物碱。5 浙江大学远程教育学院本科毕业论文（设计） 第 2 章 材料与方法2.4 标准曲线的制作精确称取 10 mg 荷叶碱标准品，将其放置于 10 mL 容量瓶中，后加入三氯甲烷定容，轻轻摇晃均匀，以备后续实验。精确吸取 1 mL 荷叶碱标准品溶液，5 mL 三氯甲烷以及 1 mL 溴甲酚绿缓冲液于分液漏斗中，轻轻摇匀后静置，吸取三氯甲烷层 4 mL 溶液放置于刻度试管中，后加入 1 mL 无水乙醇，轻轻摇匀后静置，待出现显色现象后，将其放置于紫外分光光度计下进行扫描，波长设置为 200-700 nm，以测得荷叶碱最大的吸收波长值。精确 1 mL 吸取标准品溶液置于 10 mL 容量瓶中，添加氯仿至 10 mL 刻度线，轻轻混匀，后分别吸取上述溶液 0 mL、0.5 mL、1.0 mL、1.5 mL、2.0mL、2.5 mL 标准品溶液，并放置于 5 mL 容量瓶中，用氯仿补足以定容，振荡混匀后转移至分液漏斗中，精确吸取 1 mL 溴甲酚绿缓冲液，轻轻摇匀后静置，取三氯甲烷层 4 mL 与 1mL 无水乙醇反应，后放置于上述测得的荷叶碱最大波长吸收值处进行测量，将浓度作为荷叶碱标准曲线的横坐标，吸收值作为该标准曲线的纵坐标，以求得回归方程。2.5 样品含量测定精确吸取一定量的待测样品，按上述方法测定每个样品中荷叶碱的含量，每个样品重复测量三次，取其吸光度的平均值，后根据标准曲线，将其换算成浓度，以求得待测样品中的生物碱含量。2.6 生物碱提取率的计算利用紫外分光光度计监测荷叶粉末样品中的总生物碱含量，并用 M 表示，单位为 mg/100g，提取液中的总生物碱含量用 M1 表示，单位为 mg/100g，荷叶总生物碱提取率 α（单位为%）即等于提取液中总生物碱的含量与样品中总生物碱的含量，即 M 与 M 的比值。2.7 提取条件对生物碱提取率的影响2.7.1 提取溶剂对提取率的影响取 6 份 5g 荷叶粉末样品，放置于 6 个 1000 mL 圆底烧瓶中，分别加入 100mL 蒸馏水、100 mL 0.25%稀盐酸、100 mL 75%甲醇、100 mL 乙醚、100 mL6 浙江大学远程教育学院本科毕业论文（设计） 第 2 章 材料与方法90%乙醇、100 mL 氯仿，将其放置于 90℃下提取样品中的荷叶碱，回流提取2h，经滤纸过滤后，将滤液定容至 1000 mL，测定其中的总生物碱含量，并计算总生物碱提取率。2.7.2 提取温度对提取率的影响取 10 份 5g 荷叶粉末样品放置于 1000 mL 圆底烧瓶中，每个烧瓶中均加入100 mL 90% 乙 醇 ， 分 别 将 其 放 置 于10℃、20℃、30℃、40℃、50℃、60℃ 、70℃、80℃、90℃、100℃十个不同温度条件下提取样品中的生物碱，测定其生物碱含量与其提取率。2.7.3 提取时间对提取率的影响取 7 份 5g 荷叶粉末样品放置于 1000 mL 圆底烧瓶中，每个烧瓶中均加入100 mL 90% 乙醇，将其放置于 90℃下提取样品中的生物碱，提取时间分别设置为 20 min、40min、60 min、80 min、100 min、120 min、140 min，测定其生物碱含量与其提取率。2.7.4 料液比及提取次数的选择取 4 份 5g 荷叶粉末样品放置于 1000 mL 圆底烧瓶中，每个烧瓶中均加入100 mL 90% 乙醇，将其放置于 90℃下提取样品中的生物碱，回流提取 2h，分别设置料液比为 1：5、1：10、1：15、1：20，测定其生物碱含量与其提取率。7 浙江大学远程教育学院本科毕业论文（设计） 第 3 章 结果与分析第3章 结果与分析3.1 标准曲线的绘制将 1 mL 荷叶碱标准品溶液经显色反应，置于紫外分光光度计下扫描得，荷叶生物碱最大的吸收波长值为 272 nm。因此，后续实验将待测样品置于吸收波长 272 nm 处进行检测样品中荷叶生物碱的含量。将荷叶碱标准品溶液浓度作为横坐标，测定的对应吸收度作为纵坐标，得到荷叶生物碱的检测回归方程为 Y=0.0165X+0.0030，R2=0.9993。图 3-1 荷叶生物碱标准曲线3.2 提取条件对生物碱提取率的影响提取溶剂对提取率的影响分别测定经 100 mL 蒸馏水、100 mL 0.25%稀硫酸 100 mL 75%甲醇、100mL 乙醚、100 mL 90%乙醇、100 mL 氯仿等六种不同的提取溶剂于 90℃下回流提取荷叶总生物碱 2 h，并计算其总生物碱提取率，分析数据发现，当稀硫酸作为提取溶剂时，待测样品中的总生物碱提取率最高，其次为乙醇。考虑到经稀硫酸提取过后的样品较难过滤以及浓缩，故认为乙醇是最佳的荷叶生物碱提取溶剂。表 3-1 提取溶剂对荷叶生物碱提取率的影响8