利用互联网资源简述青霉素类药物的作用原理 ——氨苄青霉素与鸭疫里默氏菌噬菌体协同作用摘要：为研究氨苄青霉素（）和鸭疫里默氏菌噬菌体的协同作用，在亚  浓度 下，测定噬菌体  对鸭疫里默氏菌  生长的影响、 形成的噬菌斑大小、增殖效果、不同噬菌体株对  的裂解情况。动物试验比较噬菌体、、二者合用对  攻击的治疗效果。结果，亚  浓度的  下， 对  生长的抑制作用提高了  倍、 噬菌斑的大小没有发生变化、 培养后子代噬菌体增加，部分噬菌体株表现出裂解  的能力。 人工感染番鸭后， 和  联合治疗组，比单用其中任何一种的效果都更好。研究表明，在体外抑制鸭疫里默氏菌的生长或体内治疗其感染， 和噬菌体都具有协同作用。该研究为应用  和噬菌体联合制剂来防控传染性浆膜炎提供了理论依据。关键词：鸭疫里默氏菌；噬菌体；氨苄青霉素；协同作用鸭疫里默氏菌（，）是革兰氏阴性的小杆菌，主要侵害 日龄以下的各品种鸭和鹅，引起的病变主要表现为纤维素性心包炎、肝周炎、气囊炎、脑膜炎和关节炎等，俗称传染性浆膜炎。该病呈世界性分布，严重影响水禽养殖业的健康发展。药物在本病的预防和治疗方面发挥了重要作用，但随着鸭疫里默氏菌耐药菌株的不断增多、多重耐药菌株的出现、耐药机制的不断变迁等，药物的应用受到了很大的限制。传染性浆膜炎灭活疫苗已商品化，当疫苗株的血清型与流行菌株的血清型相同时，灭活疫苗可以提供有 白泉阳8黄瑜77福建畜牧兽医79:鹅传染性浆膜炎的诊断与治疗67郑雅77福建畜牧兽医79: 型鸭疫里默氏菌的分离鉴定和药敏试验67郑小兰8程龙飞8黄瑜77福建畜牧兽医9:一起番鸭传染性浆膜炎的诊治报告67余勋信8关育芳77福建畜牧兽医79:一起番鸭传染性浆膜炎的诊治报告67林青8潘曦77福建畜牧兽医79:鸭疫里默氏菌 ) 型的分离与鉴定67苏文良8郭玉璞77中国兽医杂志7)9:)鸭疫里默氏菌 #'; 基因的 4.+ 分析67曲丰发8张大丙8郑献进8郭玉璞中国兽医杂志7)9:鸭、鹅传染性浆膜炎的诊治67关大勇77现代畜牧科技79: 效的保护，而鸭疫里默氏菌有超过  种的血清型，一旦流行菌株的血清型改变，则免疫效果大打折扣。因此有必要研发传染性浆膜炎的新型防治方法。噬菌体是细菌的病毒，可以作为生物控制剂，杀灭悬浮或生物膜中的细菌。噬菌体在杀死其宿主菌的同时，不损伤宿主细胞、不影响宿主体内的大多数其他细菌，因为这一优点，噬菌体治疗法正在被越来越多的人关注和接受。作者以鸭疫里默氏菌  为指示菌，从健康鸭粪中分离鉴定了鸭疫里默氏菌敏感的噬菌体 ，经形态学观察，结合分子特征，认为其应归属于  群尾病毒目长尾病毒科成员；测定了噬菌体  的生物学特性，结果表明，该噬菌体潜伏期短，裂解量大，可以作为生物防治鸭疫里默氏菌病的候选噬菌体株；以皮下注射的方法将鸭疫里默氏菌人工感染樱桃谷鸭，同时皮下注射噬菌体，观察  天，结果发现， 株噬菌体处理组均可使鸭的死亡数量减少，说明噬菌体对鸭疫里默氏菌病有一定的治疗效果。据报道，噬菌体和抗生素具有协同作用，受此启发，本研究从体内和体外两个方面探讨氨苄青霉素与噬菌体的协同作用，为抗生素与噬菌体联合应用用于防治传染性浆膜炎奠定基础。 材料与方法 主要试剂及试验动物胰 蛋 白 胨 大 豆 琼 脂 （  ! ， "# ） 、 胰 蛋 白 胨 大 豆 肉 汤（ $ %，"#&），为 '( 公司；) 孔细胞培养板，为 "% 公司；氨苄青霉素（），!*+，为全式金公司；氨苄西林钠可溶性粉，为成都市坤宏动物药业 有限公司； 日龄番鸭，购自莆田温氏家禽有限公司。 菌毒株及培养方法血 清  型 鸭 疫 里 默 氏 菌  ， 鸭 疫 里 默 氏 菌 噬 菌 体、、、、)、、、（均是以鸭疫里默氏菌  为指示菌，从健康鸭粪中分离并纯化），由福建省农业科学院畜牧兽医研究所禽病研究室保存。菌株冻干粉划线培养于 "# 平板，,烛罐中培养 %，挑单菌落接种于"#&，,振荡培养 %。噬菌体采用双层平板法培养，挑噬斑纯化、计数。每株噬菌体的效价均调整至 -./*+。 对  最低抑菌浓度（）的测定采用微量稀释法。用 "#& 将  稀释至 )0!*+，在 ) 孔细胞培养板上，以 "#&将  作倍比稀释，共  孔，每孔终体积 0+，第  孔为单纯的 "#& 为对照，每孔加 倍稀释的  菌液 0+，,二氧化碳培养箱中培养 %，测定每孔的 1') 值。做  个重复，取平均值判定  值。 与  合用对  的生长抑制试验参 考 文 献 ) 的 方 法 适 当 改 进 ， ) 孔 细 胞 培 养 板 上 ， 第 一 孔 加 "#& 稀 释 的0!*+0+ ， 后 面 每 孔 加 "#& 稀 释 的 0!*+0+ ， 第 一 孔 加0+，混匀后倍比稀释至  孔，第  孔为不加噬菌体的对照，每孔加  倍稀释的  菌液 0+，即  终浓度均为 0!*+，噬菌体浓度不同。同样的方法，设 置  终浓度分别为 0!*+、0!*+ 和 0!*+ 的试验组和对照组。,二氧化碳培养箱中培养 %，测定每孔的 1') 值。每个试验组做  个重复，取平均值进行分析。 对  噬菌斑形成的影响试验参考文献)的方法适当改进，铺双层平板，下层为 "#，上层为含  和 （ 约  个 ./ ） 的 2 琼 脂  ， 使 整 个 平 板 中  的 终 浓 度 分 别 为 0!*+、0!*+、0!*+、0!*+，每组做  个重复，,二氧化碳培养箱中培养%。观察噬菌斑的形态及大小，计算每组噬菌斑的平均数。 对  增殖的影响试验参 考 文 献 ) 的 方 法 适 当 改 进 ， 取  （ -./ ） 和（-./），加入 "#& 中，总体积为 +，平均分为  份，设定为  个试验组，加入  使其终浓度分别为 0!*+、0!*+、0!*+、0!*+，,振荡培养 %。每组加氯仿 +，上下振荡，静置 ，取上层液体进行噬菌体计数。 对噬菌体噬菌谱的影响试验铺双层平板，下层为 "#，上层为含  的 2琼脂，使整个平板中  的终浓度分别为 0!*+、0!*+、0!*+、0!*+，待琼脂凝固后，将噬菌体分别滴加在不同平板上（0+*板），,二氧化碳培养箱中培养 %，观察加样点是否出现噬菌斑，出现噬菌斑判断为具有裂解能力，否则判断为不能裂解。 与  对  人工感染番鸭的治疗试验  只  日龄番鸭，隔离饲养 3 后进行动物试验。每只左腿皮下注射 + 菌液（细菌的含量为 -./*+），然后随机分为  组。试验  组、 组和  组，立即右腿皮下注射 + 噬菌体 （噬菌体的含量为 -)./*+），试验  组在每天的饮水中加入氨苄西林钠可溶性粉 !*+，试验  组和  组在每天的饮水中加入氨苄西林钠可溶性粉 !*+（厂家的推荐用量），对照组不注射噬菌体也不添加药物。隔离饲养，观察 3，统计鸭的死亡数并计算死亡率。 结果 对  的 培养基中含有不同浓度  时，细菌的生长情况见图 ，可以看出， 浓度较高时，1' 值始终处于较低的水平，当  浓度为 0!*+ 及以下时，1' 值迅速上升。1' 值越高，说明细菌的生长越好，将能够完全抑制细菌生长的  最低浓度即 0!*+ 判定为对 的 。根据中国食品药品检定研究院制定的《抗菌药物药敏试验判断标准》判定， 对  耐药。  与  合用对  生长的影响不同浓度  与不同效价的噬菌体  合用，对  生长的影响详见图 。从中可以看出，当  浓度为 0!*+ 及以下时，噬菌体  稀释至 4，培养液的 1' 值即开始快速上升，即不能抑制  的生长；当  浓度为 0!*+ 和 0!*+ 时， 稀释至 4 时，培养液的 1' 值才开始快速上升。说明当培养液中含有 0!*+或 0!*+ 的  时，更少的  就可以抑制  的生长，也就是说， 和 联合，可以将  对  生长的抑制作用提高  倍。 对  噬菌斑形成的影响不同浓度  时，双层平板观察到的  噬菌斑的形态、大小、数量均没有明显差别。 对  增殖的影响培养液中含有不同浓度 ，培养后各试验组子代噬菌体的计数结果详见表 ，培养液中  浓度达到 0!*+ 和 0!*+ 时，子代噬菌体的数量明显增加，增加的幅度分别为 2和 2， 浓度为 0!*+ 时，对子代噬菌体的数量几乎没有影响。  和噬菌体联合应用对鸭疫里默氏菌攻菌的治疗效果攻击鸭疫里默氏菌  后，采取不同治疗措施的各试验组，死亡数量不同，详见表。两个联合治疗组的死亡率，比单一噬菌体治疗组或单一  治疗组都低。推荐剂量的 与噬菌体联合应用比一半剂量  与噬菌体的联合应用效果更好一点。说明噬菌体和 或半剂量的  合用，均能提升对人工感染鸭疫里默氏菌的治疗作用。 讨论用噬菌体治疗细菌感染早在  世纪初就已取得过可喜的成果，由于大多数噬菌体的噬菌谱过于狭窄，使得其应用受到了很大的局限，后来随着抗生素的迅速发展，噬菌体的研究工 作几乎处于停滞状态。抗生素可以抑制或杀灭病原菌，提高动物的生产性能，但其副作用也越来越显现，其应用也受到了越来越多的限制。可喜的是，抗生素的亚最小抑菌浓度已被证明能提高噬菌体的活性，被称为“噬菌体4抗生素协同作用”4。其可能的机理有两个方面，一方面是因为抗生素作用后，细菌形态发生了改变，如内酰胺类和氟喹诺酮类药物可以使伯克霍尔德菌拉伸呈丝状，暴露出更多的噬菌体结合受体，有利于更多噬菌体的吸附从而导致噬菌体产量的增加并加速细胞的裂解；四环素则使细菌成簇聚集，增加了噬菌体横向穿过相邻细菌并感染的机会从而加速其裂解作用。另一方面，噬菌体可以破坏细菌生物膜，使得抗生素更好地发挥作用。抗生素与噬菌体的合用，不仅能提高治疗效果，还能减少抗生素的使用，是一个有应用前景的方向。并不是所有的噬菌体和所有的抗生素都具有协同作用，不同的噬菌体只与部分抗生素具有协同作用，54内酰胺类、氨基糖苷类、氟喹诺酮类、多粘菌素类和四环素类抗生素被研究较多，其中，54内酰胺类和氟喹诺酮类抗生素与噬菌体的协同作用经常被发现。氨苄青霉素已被证实，能与粪肠球菌噬菌体和大肠杆菌噬菌体产生协同作用。氨苄青霉素耐酸，内服或肌肉注射均易吸收，既可抗革兰氏阳性菌，又可抗革兰氏阴性菌，在动物养殖中广泛应用，是否与鸭疫里默氏杆菌噬菌体也具有协同作用？目前还未见报道。本研究针对这一未知领域开展试验，首先在体外培养时发现，亚  浓度的氨苄青霉素能使噬菌体 对  生长的抑制作用提高  倍，能使子代噬菌体的数量明显增加，说明在体外 条件下，氨苄青霉素与  具有协同作用。美中不足的是，本研究没有观察到亚  浓度的氨苄青霉素对噬菌斑大小和数量的影响，推测可能与  形成的噬菌斑太小（直径小于 ）、不易计量有关，也可能与噬菌体本身的特点有关。另外，亚  浓度的氨苄青霉素可以使部分原先不能裂解  的噬菌体获得裂解  的能力，说明低于常规剂量的抗菌素和噬菌体的合用，可以拓宽噬菌体的噬菌谱，这一点很有意义，为噬菌体临床应用范围的拓宽提供了理论基础。其次，本研究进行了体内试验，将鸭疫里默氏菌  人工感染番鸭，然后进行治疗试验。注射噬菌体  的试验组，死亡率比对照组降低，注射噬菌体结合饲喂氨苄青霉素的试验组，死亡率更低，说明噬菌体  和氨苄青霉素具有协同作用。本研究还对氨苄青霉素的用量进行了初步的探讨，发现氨苄青霉素减半后与噬菌体合用，比单一噬菌体治疗组的效果好，但比常规剂量组略差。综上所述，本研究从体内和体外两个方面均证明，氨苄青霉素和噬菌体具有协同作用，为今后传染性浆膜炎的预防和治疗提供了可能的新方案，在保证预防和治疗效果的情况下，也可能减少抗菌药物的使用，减少药物残留和环境压力，具有潜在的重要意义。参考文献：一起鹅传染性浆膜炎的诊治67兰明钟8韦丽金77福建畜牧兽医7)9:鸭、鹅传染性浆膜炎的流行与诊治67王雪岩77畜牧兽医科技信息79:噬菌体对感染鸭疫里默氏菌鸭的疗效67程龙飞8陈红梅8郑腾8施少华8傅光华8万春和8