核酸测序技术的发展历程——以单细胞为例摘要：作物同一组织中的细胞往往被认为是具有相同状态的功能单位，传统的检测手段分析的是细胞群体的总体平均反应。而单细胞测序是在单个细胞水平对基因组或转录组进行测序分析的技术，通过对单个细胞的 DNA 或 RNA 进行测序，表明组织系统层面的功能是由异质性细胞构成的，在解决生物异质性和生物材料的低获取量等问题上具有独特优势，极大改变了人们对许多生物现象的理解。本综述概括了当前单细胞测序技术发展、测序原理、测序流程以及在作物研究中的应用，并对当前已经取得成果的应用领域进行了阐述，以期为作物单细胞测序的研究与应用提供参考。关键词:单细胞测序，单细胞分离，技术流程，作物研究近年来，随着测序技术的快速发展和进步，测序成本也在不断下降。高通量平台可以同时对数以万计的核酸分子进行测序，研究人员可以更加全面地分析全基因组、转录组、甲基化组等各项组学数据，进而快速和准确地获取生物体的遗传信息但是单个细胞异质性一般被忽略，有研究表明，单个细胞中基因的表达调控方式存在很大差异。传统的测序方法针对的是细胞群体的总体平均反应，难以对异质性细胞和低获取量细胞等进行转录组分析随着单细胞分离技术的快速发展 ，以单个细胞为研究对象对其进行测序，有利于解决细胞异质性的问题。Tang 等采用 mRNA 全转录组测序方法对小鼠四细胞期胚胎的卵裂球进行单个细胞水平分析。2011 年 MDAnderson 癌症 中心和 ColdSpringHarbor 实验室联合研究，开发了一种能够对一个单细胞核中基因拷贝数目进行准确定量的方法(Navinetal.，2011)。Ni 等(2013)首次利用肿瘤病人单个外周血循环肿瘤细胞进行全基因组检测，为无创肿瘤诊断和监测提供了一种新的技术手段。 Poulin 等(2016)利用单细胞测序技术，揭示了神经系统中复杂的基因调控网络和细胞分化谱系。最近，研究者通过单细胞转录组测序，对各种干细胞注射的胚胎嵌合能力进行比较，发现其表达水平在不同的细胞类型里存在一定差异，这种差异解释了为何不同细胞类型具有不同的嵌合能力。植物中每个细胞都是独一无二的，即使是相同细胞系或个体来源的细胞，彼此的基因组、转录组和表观基因组等都会有所差异。传统的检测手段分析的是细胞群体的总体平均反应，而单细胞测序是以单个细胞为起始材料，可以揭示单个细胞的转录变化，在解决生物异质性和生物材料的低获取量等问题上具有独特优势。因此，要想更好地理解各类生物现象，单细胞水平上的研究显得日益重要。一、单细胞测序技术的原理单细胞测序技术是利用单个细胞为研究对象，对其基因组和转录组等进行测序和分析，以检测其基因组结构的差异、基因表达水平的差异、选择性剪接的差异、表观基因组的 DNA 甲基化状态以及染色体相互作用在基因组上的跨度分布等(Liangetal.，2014)。单细胞测序与一般的测序基本一样，主要有基因组测序、转录组测序、表观遗传学测序和三维基因组测序等。单细胞基因组测序是对单个细胞的全部基因组序列进行非选择性、均匀扩增，接着使用高通量测序的过程 。转录组测序是通过获取特定器官或组织，获得在一定自然或处理状态下的几乎所有转录本。表观 遗传学测序则主要揭示基因表达调控，主要有 DNA 甲基化、组蛋白修饰等。三维基因组学测序，主要包括染色体的空间结构与空间相互作用、染色质结合结构和调节蛋白等方面的研究。二、样品单细胞分离技术样品中单细胞的分离是单细胞测序的前提和基础。目前单细胞分离的技术有多种方法 (表1)，主要有显微操作法、荧光激活细胞分选法、梯度稀释法、激光捕获显微切割方法和微流控平台等不同的分离方法。（一）梯度稀释方法梯度稀释法是指通过浓度稀释的方法，将样品细胞的浓度稀释趋于单个状态，该技术已成功应用细胞体外克隆相关研究中。该方法操作简单，但不是单个细胞的分离，只是细胞浓度最终接近单个细胞水平，这样导致出现误差的几率较大。（二）显微操作法显微操作法是指利用显微操作技术将样品中的细胞分离成单个细胞，是一种获取单个细胞的有效方法。此技术主要应用于目标细胞群体中数量较少的样品分离，虽然能够高效地控制单个细胞的吸取和释放，但在细胞识别的过程中易出错，且分离过程中容易损伤活细胞。（三）荧光激活细胞分选法荧光激活细胞分选法是以流式细胞仪为辅助设备，利用样品细胞中的标志直径大小和颗粒度等相关参数，将单个目标细胞分别打入实验孔板的每个孔中。该方法最大优点是能够对不同的细胞进行分选，如特异和非特异的细胞均可以分选，且具有较高的准确度和通量。 （四）激光捕获显微切割法激光捕获显微切割法，是将样品细胞固定在有激光脉冲激活的涂片上，显微镜直视下选择并激光切割目标细胞。利用该技术可以在显微镜下准确、快速地获取单个细胞。由于该技术是利用切割目的细胞周围来获得单细胞，需要维持组织细胞的活性，容易受到周围边缘细胞的污染。其次，该技术容易造成细胞死亡，操作过程极为复杂，且通量低。（五）微流控平台的方法微流控平台法是指利用控制微流体芯片中的液体流动的速度来捕获单个细胞。该技术在降低单细胞测序的噪声和基因组扩展方面具有较强的优势其次，微流体芯片的微量反应容积还提高了扩增的精确率和反应效率，研究者已经将该技术应用于他们的研究。微流控平台成功的事例主要有 In-drop、Drop-seq 和 10×Genomics，是利用非水混悬剂中的微小水滴包裹单细胞，然后将捕获的单细胞进行裂解并进行标记，最后进行反转录和扩增。该技术方法不仅能获得样品中单个细胞，同时后续反应过程可以自动化进行，是集细胞裂解、细胞分选、扩增和建库于一体的技术。这些方法各有利弊，根据样本情况选择合适的方法。三、单细胞测序技术流程单细胞测序主要包括单细胞分离、核苷酸序列(DNA 或 RNA)扩增、建库测序和数据分析。由于单个细胞的核酸量很低，其基因组内只有一到两个拷贝，因此为获得通量的有效数据，核酸扩增是必须的。单细胞扩增主要包括细胞裂解、核酸处理和 DNA 扩增，无论是表观遗传学测序、 基因组测序、转录组测序、三维基因组学测序及其他方面的测序，必须包含以下步骤（图 1）。这 4 种测序类型优势和特点各不相同，均可以从不同角度揭示细胞不同发育阶段的功能和特性。全基因组测序是利用单个细胞溶解得到微量基因组 DNA，获得高覆盖度的单细胞全部基因，可进行突变热点分析和全基因组变异全局分析。转录组测序是从 RNA 水平来深入研究相关基因的表达和调控变化，可以进行差异基因表达分析、聚类分析、可变剪切分析、富集分析和功能注释分析等。表观遗传学测序，可以分析全基因组甲基化图谱 DMR 区域分布情况和甲基化差异情况。三维基因组学测序，即研究基因空间结构情况，可以分析染色体相互作用在基因组上的跨度分布，染色体顺反式相互作用频率分布等。 四、单细胞测序技术在作物研究中应用情况单细胞测序技术已迅速发展并应用于许多领域。例如，胚胎发育阶段转录组分析，器官发育方面的转录组分析，免疫系统方面的转录组分析等。而在作物方面的研究还不多，研究人员通过对玉米 96 个小孢子的全基因组测序分析，首次准确计算出玉米单个细胞进行一次减数分裂，所发生重组交换的平均次数。同时首次证实了外界环境的变化可以影响重组频率。该研究的技术创新，不但对玉米重组规律有了新认识，还可以将该技术应用于其它作物的单细胞研究，为遗传改良作物提供极其重要的信息价值。五、展望单细胞测序技术虽然在生物领域方面取得丰富的成果，但是还存在一些问题：(1)单细胞分离难度大；(2)扩增容易失败，出现非特异性扩增；(3)建库中会出现样品污染；(4)检测灵敏度偏低；(5)操作失误率高，技术噪音高；(6)实验的重复性差；(7)非编码 RNA 难以检测。为了使单细胞测序技术能在未来生命科学中发挥更大作用，需要从以下 3 个方面进行提升和优化：(1)高通量。未来不能只对单个样品或细胞进行分析，应该朝着大规模集成化和高通量的方向发展，进而节约大量的实验成本，提高工作效率。(2)自动化。目前单细胞测序程序非常复杂，很多实验过程都需要人工操作(图 1)，其中最关键的两个步骤(单细胞分离和核酸处理)更是对实验人员的操作技术有很高的要求，使得该技术的效率和准确性不高。因此，单细胞测序技术应朝着自动化方向发展，争取实现整个测序过程自动化。(3)结合其他技术。为了使单细胞测序技术能在未来发挥更大的作用，应该将细胞成像技术和细胞切割等技术进行结合。 参考文献：[1]利用单细胞测序技术追踪胚胎发育中细胞的演变过程[J]. 王萍. 科学通报. 2020(07)[2]下一代测序技术在乳业中的应用[J]. 林少华,罗红霞. 中国乳业. 2020(04)[3]单细胞测序技术及其在植物中的研究进展[J]. 何其邹洪,鄂一岚,李瑞丽. 中国细胞生物学学报. 2020(04)[4]第三代测序技术的方法原理及其在生物领域的应用[J]. 张子敬,刘燕蓉,张顺进,贺花,李佳霄,刘贤,吕世杰,李志明,王二耀,雷初朝,黄永震. 中国畜牧杂志. 2020(06)