巨噬细胞在免疫应答阶段的生物学作用目的：探讨小鼠腹膜巨噬细胞在病毒感染早期免疫应答功能的差异及其相关机制。 方法采用流式细胞术对小鼠腹腔 F4 / 80hi 亚组和 F4 / 80lo 亚组巨噬细胞进行分类。 经过 8 个小时的polyI：C 免疫刺激后，使用实时定量 PCR 比较两个人群的促炎因子和相关转录因子基因。 为了表达变化，Westernblot 方法进一步用于检测信号通路的变化，最后，通路抑制剂被用于阻断实验。 结果小鼠腹腔 F4 / 80hi 亚组的巨噬细胞数量明显高于 F4 / 80lo 亚组（P <0.05）。PolyI：C 后，F4 / 80hi 亚组中促炎因子 IL6，iNOS，IFNα，IFNγ 的基因表达显着高于 F4 /80lo 亚组（P <0.05）。 转录因子 IRF3 和 IRF7 基因显着增加（P <0.05）； 同时，F4 / 80hi亚组 JNK 途径的磷酸化水平显着升高（P <0.05）； 切断后，SP600125（JNK 信号通路的磷酸化抑制剂）被阻断，促炎因子 IL6 和 IFNα 基因的表达明显下调（P <0.05）。 结论在病毒感染的早期阶段，F4 / 80hi 巨噬细胞亚群比 F4 / 80lo 巨噬细胞亚群更活跃。 它可能通过上调 IRF7分子的表达和 JNK 途径的激活水平来参与巨噬细胞激活的调控。关键词：巨噬细胞亚群; 病毒早期感染; 免疫应答;巨噬细胞是免疫系统中的重要组分，对机体稳态维持、病原清除起着至关重要的作用。巨噬细胞具有较强的可塑性，按其功能表型、驻留器官、来源发育等，可分为不同的细胞亚群。根据其释放促炎/抑炎细胞因子或趋化因子的功能行为，可分为经典活化 (classicallyactivated)的M1 型巨噬细胞亚群和选择性活化(alternativelyactivated)的 M2 型巨噬细胞亚群。根据其各类 驻留器官划分，可分为库佛细胞(肝组织)、朗格汉斯细胞(皮肤组织)、肺泡巨噬细胞(肺组织)、破骨细胞(骨组织)、小胶质细胞(脑组织)等巨噬细胞亚群。根据来源，可将其分为胎肝造血干细胞来源、胚胎造血干细胞来源和成体骨髓造血干细胞来源的巨噬细胞亚群。有研究报道表明，腹腔巨噬细胞具有一定的溯源异质性，其 F4/80hi 巨噬细胞亚群来源于肝造血干细胞，在稳态环境下依赖于自我增殖维持细胞群体数量的恒定；F4/80lo 巨噬细胞亚群由骨髓造血干细胞来源的单核细胞发育而来，在机体遭受细菌感染或病毒侵扰的 24～72h，被大量募集并向 F4/80hi 巨噬细胞亚群定向分化。然而在病毒侵染早期，腹腔巨噬细胞 F4/80hi 亚群和 F4/80lo 亚群是否具有免疫应答功能的异质性，仍未获曾阐明。聚肌胞(PolyI∶C)是一种天然双链Ｒ NA(ds Ｒ NA)的类似物，能够有效模拟病毒感染后所形成的 ds Ｒ NA，刺激机体产生抗病毒免疫反应和炎症反应。已有报道表明，PolyI∶C 可与成熟巨噬细胞表面 Toll 受体 3(TL Ｒ 3)受体结合，通过活化下游髓样分化因子 88(MyD88)蛋白或 β 干扰素 TL Ｒ结构域衔接蛋白(T Ｒ IF)两种方式，诱导 Ι 型干扰素(IFN)产生，进而触发炎性反应。然而，目前对于异质性巨噬细胞抗病毒功能与机制的研究仍较少。因此，进一步深入研究巨噬细胞亚群感染早期病毒免疫应答作用与机制，对理解机体免疫系统早期病毒识别与应答调控具有重要意义 。本实验通过研究 PolyI∶C 免疫刺激对小鼠腹腔 F4/80hi 和 F4/80lo 巨噬细胞亚群各类促炎因子和转录因子基因表达水平的影响，并进一步探究信号通路相关机制，以期为病毒感染的免疫应答调控研究提供理论依据和新思路。 一、材料和方法（一）实验动物SPF 级 C67BL/6J 雄性小鼠，6～8 周龄，20 只，体重 20～22g，购于北京维通利华实验动物 技 术 有 限 公 司 ［ SCXK( 京 )2016 － 0006 ］ ， 于 西 安 交 通 大 学 医 学 部 动 物 实 验 中 心［SYXK(陕)2015－0002］SPF 级环境繁育饲养。温度 20℃～25℃，相对湿度 40%～70%，每天 12h 昼夜明暗交替。本研究所有动物实验依据优化、减少、替代的 3 Ｒ原则进行实验设计，并经过西安交通大学动物实验伦理委员会批准(XJTULAC2018－2225)。（二）主要试剂与仪器小鼠 CD11b、F4/80 流式抗体(1∶200，Biolegend，美国)；Ｒ PMI-1640 培养基、胎牛血清(Gibco，美国)；PolyI∶C(Sigma，美国)；Ｒ NA 提取试剂 T Ｒ Izol(Invitrogen，美国)；cDNA 合成试剂盒(Thermo，美国)；SYB Ｒ Green 荧光定量盒(TaKa Ｒ a，日本)；BCA 蛋白浓度定量试剂盒(Thermo，美国)；JNK 抗体(1∶500，CST，美国)；P-JNK 抗体(1∶500，CST，美国)；GAPDH 抗体(1∶500，CST，美国)；羊抗兔 H Ｒ P 二抗(1∶3000，北京中杉金桥生物技术有限公司)；JNK 磷酸化抑制剂 SP600125(MedChemExpress，美国)；引物序列合成(北京六合华大基因科技股份有限公司)。（三）实验方法选取 6～8 周龄 C67BL/6J 小鼠，脱颈处死，使用预冷的 PBS 缓冲液反复冲洗腹腔，离心后重悬，置于冰上裂解红细胞 10min。离心后重悬行细胞计数，取 5×106 细胞，同时加入 5μL 的 CD11b-PE-Cy7 和 F4/80-APC 抗体，避光冰上孵育 30min 后，离心去上清。将细胞加入 1mL流式缓冲液重悬，过 200 目无菌滤网后上机进行流式细胞分选和分析，所使用流式细胞仪为 A ＲIAΙΙ(BD，美国)。共分选 20 只小鼠腹腔巨噬细胞，获得的小鼠 CD11b+F4/80hi 巨噬细胞亚群和 CD11b+F4/80lo 巨噬细胞亚群，一部分(8 只小鼠样本)用于荧光定量 PC Ｒ检测促炎因子和转录因子 m Ｒ NA 表达的检测，一部分(6 只小鼠样本)用于 JNK 通路拮抗实验，另一部分(6 只小鼠样本)用于 Westernblot 检测信号通路磷酸化水平的检测，所有实验均至少开展三次独立重复实验。将 PolyI∶C 干粉溶于 PBS 中，调整为终浓度 2mg/mL 的储液，冻存于－80℃冰箱备用。本实验共设计两个 PolyI∶C 浓度组，分别为对照组(0μg/mL)，实验组(50μg/mL)，将作用后的F4/80hi 亚群和 F4/80lo 亚群置于 5%CO2 浓度和 37℃温度下培养 8h。将 JNK 通路磷酸化抑制剂 SP600125 干粉溶于 DMSO 中，调整为终浓度 10mmol/L 的储液，低温冻存备用。在实验组加入 PolyI∶C 刺激的同时，设置加入 SP600125(10μmol/L)处理组和同体积 DMSO 对照组(每组3 个样本，每个样本为分选的 6 只小鼠细胞两两合并)，同上述条件培养 8h。二、结论流行性感冒病毒(流感病毒)其感染的严重程度，和病毒引起的以过度炎症反应为特征的细胞因子风暴呈正相关。部分宿主在感染 H1N1 流感病毒后，免疫细胞过度激活进而释放大量促炎细胞因子，引发细胞因子风暴，可发展为急性肺损伤，甚至可进展为急性呼吸窘迫综合征，导致呼吸衰竭与多器官损伤。本研究通过研究异质性巨噬细胞亚群对早期病毒感染差异化应答及相关机 制，发现在 PolyI∶C 诱导的病毒感染模型中，F4/80hi 巨噬细胞亚群在病毒感染早期活化程度显著性高于 F4/80lo 亚群。F4/80hi 巨噬细胞亚群释放大量的促炎细胞因子 IL6，IFNα、IFNγ，同时转录因子 I Ｒ F3 和 I Ｒ F7 显著上调，通过活化 JNK 信号通路推进其促炎表型的形成，而抑制JNK 通路磷酸化可显著抑制 F4/80hi 亚群致敏性。该结果进一步提示我们，定向干预 F4/80hi 巨噬细胞亚群过度激活，可能对抑制或延缓细胞因子风暴的发生起着积极重要作用。固有免疫系统是机体抵抗病毒侵染的第一道防线，同时也是适应性免疫发展的基础。近年来，固有免疫中树突状细胞(DC)和巨噬细胞在抗病毒中的作用备受关注。髓系 DC(mDC)可以主动摄取乙肝病毒抗原肽，通过 MHCΙ 类分子途径提呈抗原肽至 CD8+T 细胞，进而引发 Th1 型免疫反应。而在巨细胞病毒感染中，浆细胞样 DC(pDC)可通过分泌干扰素诱导 Th2 型免疫反应。有报道表明，M1 型巨噬细胞过度活化可导致急性流感病毒感染患者细胞因子风暴的产生，在感染早期介入抑制 M1型巨噬细胞的过度激活，可以有效改善预后。在本研究中我们发现，F4/80hi 巨噬细胞亚群在早期病毒感染中促炎因子 IL6、iNOS、IFNα、IFNγ 表达上调。已有报道表明，F4/80hi 巨噬细胞亚群成熟度和吞噬能力高于 F4/80lo 亚群。提示我们在病毒感染早期，可以通过氯磷酸盐脂质体类药物清除过度活化的 F4/80hi 亚群，以降低细胞因子风暴产生风险。然而随着病毒感染进程的推进，F4/80lo 巨噬细胞亚群可能定向发育为 F4/80hi 亚群，此时采用氯磷酸盐脂质体清除巨噬细胞后是否能够抑制过度激活、能够真正利于机体病毒清除还有待进一步研究。综上，研究异质性巨噬细胞在病毒感染免疫应答与活化中的作用与机制，进而探讨并开发新 的免疫抑制剂与靶向小分子抑制剂，对防止或延缓病毒侵染导致细胞因子风暴的发生具有重要意义，同时将为疾病的预防与治疗提供积极的帮助。参考文献：[1]TLR 信号转导通路及其抗病毒感染机制的研究现状 [J]. 朱博,冷静,王坤. 现代免疫学.2019(04) [2]抑制巨噬细胞 Act 1 表达对黑色素瘤肺转移的影响[J]. 王佳,李丽,黎冰林,卢鑫,王丽京,杨永霞. 中国比较医学杂志. 2019(04)[3]流式细胞术分析 PMA 诱导 THP-1 分化为巨噬细胞的表型特征[J]. 彭卓颖,李想,丛喆,薛婧.中国比较医学杂志. 2020(10)[4]小鼠腹腔巨噬细胞的异质性观察[J]. 陈冲,冯文利,王荣,杨斐斐,王丽娜,郑国光. 山东医药.2019(42)[5]细胞因子风暴在流行性感冒病毒感染中的作用及防治研究[J]. 张海祥,谢鑫,张科进,胡军.细胞与分子免疫学杂志. 2019(05)