西南大学网络与继续教育学院课程考试试题卷类别：网教 专业：园艺 课程名称【编号】：园艺植物离体培养【0721】 A 卷大作业 满分：100 分 一、大作业题目：（以下 5 个题目任选 4 题作答，每题 25 分） 1、术语解释：外植体；离体培养 2、术语解释：不定芽；细胞全能性 3、简述花药培养的程序。 4、超低温保存有哪几个主要环节？ 5、茎尖培养有哪些方面的意义？ 二、大作业要求（包括格式、字数、字体等）：1. 严禁直接抄袭别人的作业答案。2. 建议用小 4 号宋体，段前的间隔为 0.5 倍行距。3. 答题时的的量和单位符号、数字用法等必须符合国家标准和国际标准。外文字母应注意区分正斜体和大小写。上、下角的字母、数码和符号，其位置的高低应有明显区别。 三、大作业提交方式由网继院考务办在试题卷和管理系统中填写。一 、答：1）外植体 用于组织培养(离体培养)的植物材料，如根、茎、叶、花药、胚珠等。 2）离体培养 指从植物体分离符合需要的组织，器官或细胞(包括去壁后的原生质体、离开花 药的花粉细胞等)等作为外植体，通过无菌操作，在人工控制条件下进行培养，以获得再生 的完整植株或生产具有经济价值的其他生物产品的一种技术。二、答：1）不定芽 在植物离体培养中，由外植体脱分化形成愈伤组织，继而形成一些分生细胞，分化形成 一些芽丛，这些芽即是不定芽。- 1 - 2）一个完整的植物细胞拥有形成一个完整植株所必需的全部遗传信息，植物细胞在适宜条件下具有发育成完整植株的潜在能力。三、答 1、材料选取花药接种前一般需预先用醋酸洋红，I-KI 溶液或浮尔根等染液进行压片镜检，以确定花粉的发育时期，并拭出花粉发育时期与花蕾或幼穗大小，颜色等特征之间的相应关系。一般而言，以单核中、晚期的花药进行培养是目前培养成功的主要时期。据颜昌敬统计的 13 种作物，其中有 11 种作物适宜单核期。2、预处理 （1）低温预处理（2）变温处理（3）离心预处理（4）乙烯利预处理3、消毒花药培养时，材料的表面消毒通常比较方便，因为未开放的花蕾中的花药为花被所包裹，本身处于无菌状态之中。花蕾或幼穗的表面消毒一般用 70%酒精在表面擦拭或浸一下后，在泡和漂白粉上清液中浸 10-15 分钟，或用 0.1%HgCl2 消毒 7-10min，然后用无菌水冲洗 3-5 次即可。在操作熟练的情况下，也有仅用 70%酒精将花器表面擦净即取花药的，消毒时间一般不宜过长，否则消毒剂渗入花蕾内，如花药接触药剂，又冲洗不净，会影响培养后的生长。4、接种取出花药应在无菌条件下进行，在取花药时，应注意解剖器具尽可能不碰或少碰花药，以免受伤。接种时花要直接接触培养基，如果花丝牵着花药，不让它沿着培养基，则花粉就不会生长；同时，花丝在培养基上的生长会抑制花粉的分裂增殖，接种时速度要快，尽量减少花药在空气中的停留的时间，取出花药后直接投入培养基也很好。直径 3cm 的试管，每管接种 30-60 粒。5、脱分化培养接种后放入培养室，温度通常为 25-28℃。脱分化要根据材料不同，选取基本培养基和适当生长素浓度进行养，经 10-30 天可诱导愈伤组织形成。6、再分化培养愈伤组织增殖到 1-3mm 大小时，应及时进行再分化培养，以获得花粉植株。这时要选择适当激素种类和水平的培养基上进行培养，约经 20-30 天，就能诱导苗的分化。7、花粉植株移植当花粉植株的根系生长良好时，就要及时炼苗并移至苗床或大田。由于这是一个由异养到自养的转变过程，必须细心料理，保持幼苗的水分平衡和促进新根的发生。8、染色体加倍- 2 - 当单倍体植株产生后，应在适当的时期通过人工方法进行染色体加倍。常用的方法是用0.02-0.4%秋水仙素处理。双子叶植物处理生长点，禾本科植物在分蘖期处理四、答：种质资源超低温保存技术应把握以下一些重要环节：（一）外植体的选择与处理1、材料应选择幼龄的组织细胞，因其胞质稠密，抗冻力强。 2、取材以冬天生长的植株为宜，在贮藏前往往对外植体进行预培养和低温处理，以提高组织细胞的抗寒能力。①预培养一般 7-12 天，培养基中加入能提高抗寒能力的物质，如山梨糖醇、ABA，或增加糖的浓度等。②低温处理的做法是将外植体放在 2-3℃低温下锻炼数天，处理后可明显提高材料的抗冻能力。③超低温处理前，还必须进行冷冻保护剂处理，其方法为：先将保护剂配好预冷至 0℃，等体积与培养基混合，静置 30-60min。这是因为 DMSO 等保护剂有毒，所以必须在 0℃下处理，而且处理时间不宜过长，一般不超过 1h。（二）降温冷冻材料经冷冻保护剂处理 30-60min 后，应立即降温冰冻，最后达到液 N 温度保存。从0℃-196℃的降温过程通常有三种方法。1、快速冰冻法将材料从 0℃（或其他预处理温度）直接放入液 N 中的冰冻方法。此法适于那些高度脱水的植物材料，如种子、花粉、球茎或块根等。一些抗寒木本植物的枝条和冬芽，经过冬季的细胞外结冰充分脱水后，也可采用此法。此外，不少植物的茎尖组织保存用此法也有成功的报道。快速冰冻的原理在于：利用超速冷冻，可使细胞内的水迅速通过了冰晶生长的危险温度区（-10--140℃），使细胞内水分还未来得及形成冰晶中心，就降到-196℃的安全区，此时，细胞内的水为玻璃化状态，该状态对细胞结构不产生破坏作用，从而减轻或避免细胞内结冰的危害。2、慢速冷冻法在冷冻保护剂存在下，以 0.1-10℃/min 下降的速度降温进行冰冻。在这种降温速度下，可通过细胞外结冰，使细胞内的水减少到最低限度，从而达到良好的脱水效应。此法需用程序降温仪，技术系统昂贵，但对许多不抗寒的植物保护却能带来成功。3、两步冰冻法 第一步用慢速降温法降到-30-50℃左右，使细胞达到保护性脱水状态；第二步投入液 N 中迅速冷冻目前实际工作中大多是先采用每分钟降低0.5-4℃的速度降到-40℃，然后投入液 N。烟草、萝卜、长春花、水稻、甘蔗、玉米、大豆、人参等悬浮液细胞或愈伤组织均以此法获得了成功。（三）化浆（解融）方法解融是再培养能否成功的关键。升温对细胞带来的伤害乎与降温伤害同等重要。升温损伤主要是迁移性再结晶的结果，即降温过程中形成的小冰晶重新增长的结果。同时，化冻过慢，从-196℃-0℃的升温过程中，细胞内玻璃化水可能会发生次生结冰，从而是破坏细胞结构，导致死亡。许多实验表明，缓慢升温可能使细胞内冰晶生长，而快速升温则可取得相对较高的存活率。所以一般的解融方法是采用快速法，即将样品从液 N 中取出后直接在 37℃水浴中化冻。（四）生活力及存活率的测定- 3 - 对解融后的材料，必须检测其生活力水平及存活率。常用方法有三：1、再培养即化冻后，将外植体转移到新培养基上培养，观察其是否有生活力，这是最可靠的检查法，但比较费时。2、FDA 法（双醋的荧光素）用于悬浮培养细胞等单细胞材料，以 0.1%FDA染料 1 滴，与等体积化冻后的细胞悬浮液混合后于荧光显微境下观察记数。（活细胞由荧光镜下呈黄绿色、荧光）。3、TTC 法其原理是活细胞内有脱氢酶能还原 TTC 为红棕色物质，所以活细胞被染色。（五）冰冻保存的基本操作程序，具体的技术处理和指标可以根据不同材料加以适当修正。- 4 -