西南大学网络与继续教育学院课程考试试题卷类别：网教 课程名称【编号】： 细胞工程 【1117】 A 卷大作业 满分：100 分 一、问答题（84 分）（14 分/题，共 84 分）1.简述植物细胞的脱分化的分子调控机理。答：真核生物细胞中存在有复杂的调节细胞周期的关键分子，它们通过相互制约或偶联形成复杂而精确的细胞周期调控网络。在这些关键分子中，cyclin(细胞周期蛋白)和CDK(cyclin-dependent kinase，周期蛋白依赖激酶)是两类主要的调控分子。细胞周期运行的动力主要来自 CDK，其活性则主要通过 cyclin 调节。CDK 的活性还受另外一类蛋白质的负向调节，这类蛋白质被称为 CKI(cydin-dependent kinase inhibitor，周期蛋白依赖激酶抑制子) 。因此，科学家形象地把 CDK 比作引擎，而 cyclin 则是油门，CKI 是刹车(吴家睿，2002)。植 物 细 胞 周 期 的 调 控 主 要 有 两 类 CDK(CDK-a 、 CDK-b) 和 两 类 细 胞 周 期 蛋 白(CycB、CycD) 。在环境或激素等外界条件作用下，CycD 基因首先表达生成 CycD，在相关调节因子的帮助下，CycD 与 CDK-a 结合形成 CDK-a-CycD 复合体使 CDK-a 活化，进而对 Rb(G1 期限制点调控分子)磷酸化，使细胞通过“限制点”进入分裂周期。当细胞进入分裂周期后，则由 CDK-b 与 CycB 以及相关的调节蛋白完成从 S 期到 M 期的调控。植物激素是离体培养中所必需的条件，因此，与植物激素相关的基因表达被认为是启动细胞脱分化的关键。在细胞脱分化和促进细胞分裂的过程中，PSKα 可能介导了与生长素和细胞分裂素密切相关的信号转导途径。2.简述生物反应器的几种类型及其特点答：（1）搅拌式生物反应器搅拌式生物反应器具有混合程度高、适应性广、反应器内温度、pH、溶氧及营养液浓度较易控制等优点，因而在大规模培养中被广泛使用。（2）气动式生物反应器它具有剪切力小、结构简单、避免污染等优点，因而被认为是适宜于植物细胞培养的一类反应器。气动式生物反应器主要有鼓泡式 (bubble column bioreactor)和气升式(airlift bioreactor)两种类型。鼓泡式生物反应器其主要优点是没有运动部件，操作不易污染，放大容易，适宜于对剪- 1 - 切力敏感的细胞培养。此外，混合不均匀，液体流动与传质性能检测困难也是该反应器的不足。气升式生物反应器它通过空气循环搅拌培养液，不仅可以保证良好的液体流动性，同时还具有较高的氧传递效果、反应器结构和操作也相对比较简单等特点，因而近年来已在植物细胞规模化培养中广泛使用。（3）固定化细胞生物反应器植 物 细 胞 固 定 化 生 物 反 应 器 有 3 种 类 型 。 一 是 填 充 床 生 物 反 应 器 (*xed-bedbioreactor )。由于颗粒问的挤压，常容易造成颗粒破碎使填充床阻塞。同时，混合不均匀、床内氧传递速率低等也是该反应器的主要缺点。（1 分）二是流化床生物反应器(,uid-bed bioreactor )。反应器中利用流质的能量使支持物颗粒处于悬浮状态，混合效果较好。但流体的切变力和颗粒的碰撞常造成颗粒破损使细胞外流，同时流体力学的复杂性也使其放大较困难。三是膜生物反应器(membrane bioreactor)。具有容易控制、易于放大、产物易分离、简化下游工艺等优点。但由于膜材料的限制，构建膜生物反应器的成本较高。（4）光照生物反应器植物独特的光合作用功能，使得植物细胞内的多种酶需要光照的刺激和诱导才能合成或表现较高的生理活性。目前人们主要采用在生物反应器的内部设置光照系统，一般是在搅拌或者气升式生物反应器基础上进行改造。（5）转鼓式生物反应器转鼓式生物反应器具有悬浮系统均一、低剪切环境、供氧效率高、防止细胞粘壁的优点适合于高密度植物悬浮细胞的培养。但该反应器的旋转需要专门的变速装置，电能的消耗较多。（6）其他类型的生物反应器空气和细胞双升式生物反应器，在植物细胞培养研究中也经常有使用。植物细胞装入半透膜做成培养袋中，这种膜具有非常好的氧、氮和二氧化碳透性，在培养袋中培养的烟草细胞表现出与摇瓶培养相当的生长速率和次生代谢物合成能力。3.简述超低温保存的几种方法和特点答：超低温保存指-80℃以下低温下，活细胞的物质代谢和生命活动几乎完全停止，而恢复到常温后，植物仍能进行正常的生命活动的离体保存方式。常用保存方法：冷冻诱导- 2 - 保护性脱水的超低温保存和玻璃化处理的超低温保存4.培养基的组成成分有哪几类，在离体培养中的功能是什么？答：1）天然培养基。对促进细胞生长繁殖、粘附及中和物质的毒性有一定作用。  2）合成培养基。血清的加入对培养非常有效，但对培养产物的分离纯化和检测会造成不便。  3）无血清培养基。细胞外基质能帮助细胞附着和铁壁；低分子营养成分是细胞生长和代谢所需的；激素与生长因子促 进细胞生长繁殖；酶的抑制剂，保护细胞不受培养基内残留酶的损伤。5.简述利用茎尖分生组织培养脱除植物病毒的几种原理。答：答：基本原理：早在 1934 年，White 发现烟草花叶病毒(TMV)在烟草根中的分布是不均匀的，越靠根尖(root tip)区病毒含量越低，在根尖的顶端(生长点)不含病毒(White，1934)。推测，病毒在烟草茎中的分布也可能存在与根部组织同样的情况，茎尖分生组织(apical meristem)也应不带病毒。研究证实，根尖和茎尖分生组织并不是完全没有病毒。病毒在植物体内分布不均匀性的机理目前还不十分清楚，但根据病毒及分生组织的特性，学者们提出一些假说，主要有以下几种：① 能量竞争：病毒核酸和植物细胞分裂时，DNA 合成均需要消耗大量的能量。分生组织细胞本身很活跃，其 DNA 合成是自我提供能量自我复制。而病毒核酸的合成要靠植物提供的能量来实现自我复制，这就产生细胞分裂与病毒复制对能量的竞争。病毒可能得不到足够的能量来进行核酸复制，所以导致在分生组织中没有病毒或病毒含量低。而分生组织以下的细胞分裂不活跃，主要是生长，因此病毒可以在这些细胞中获得足够的能量用于复制。② 传导抑制：认为病毒在植物体内的传播主要是通过维管束实现的，但在分生组织中，胞间连丝(plasmodesma)和维管组织还不健全，可能抑制病毒粒子(virus particle)向分生组织的传导。③ 激素抑制：在分生组织中，生长素和细胞分裂素水平均很高，因而阻滞病毒的侵入，或者这种高水平的激素浓度抑制病毒活性，但这一假说还没有充分的事实证明。④ 酶缺乏：认为病毒合成可能需要酶的参与，但在分生组织中缺乏或还没建立起病毒复制所需的酶系统，因而病毒无法在分生组织中复制。这种说法亦尚待证明。⑤ 抑制因子：认为在分生组织中病毒含量低是因为分生组织自然地存在某种抑制因子，这种抑制因子也可能是有性繁殖种子通常不带病毒的原因。这种解释也还没有直接的证据。6.一个好的悬浮细胞系有哪些特征？建立细胞悬浮培养体系有哪些关键环节？答：建立细胞悬浮培养体系，一般采用愈伤组织作为起始细胞来源，以愈伤组织为起始细胞的悬浮培养技术，其关键主要包括愈伤组织诱导、悬浮系的建立与继代培养、细胞生长状态调控等几个环节。① 愈伤组织诱导以愈伤组织作为细胞悬浮培养的细胞来源，首先就必须诱导出适宜的愈伤组织。诱导愈伤组织，首先必须选择适宜的植物外植体材料其次，培养基的附加成分对建立疏松易散的愈伤组织具有较大的影响，特别是生长素的浓度至关重要。除了生长素外，配合一定浓度的细胞分裂素也是十分必要的。还需附加一定浓度的水解酪蛋白、脯氨酸、谷氨酰胺等有机物质。培养基的蔗糖浓度也会影响愈伤组织的形态。在继代培养中不断选择那些疏松性好、细胞状态好的细胞不断继代培养，才能获得大量均匀一致、疏松易碎、适合于建立悬浮细胞系的愈伤组织。另外，缩短继代培养的时间间隔，可以有效提高疏松愈伤组织的诱导率。② 悬浮系的建立与继代培养在培养初期，悬浮细胞培养物可能呈现黏稠状，影响细胞生长，因此每隔 3 天左右要更换一次新鲜培养基。连续继代培养一段时间后，这种情况可自行消失。为了保持悬浮细胞一直处于一个相对稳定的良好状态，一般每隔 1～2 周甚至更短的时间就要继代一次。每次继代时均要进行选择，筛选细胞生活力好的细胞继代，淘汰过大和- 3 - 生理状态不好的细胞和细胞团。筛选方法一般采用蔗糖梯度离心法，有时为了简便也可采用过滤法。③ 悬浮细胞的生长动态悬浮培养系统中，细胞数量随着培养时间的变化，其扩增生长呈 S 形曲线。在细胞接种最初的 时 间内 细胞 很 少 分 裂 ， 经 过一 个 延 迟 期 (lagphase) ， 然后 进入 指数 生 长 期(exponential growth phase)和细胞迅速增殖的直线生长期(linear growth phase)，接着是细胞增殖减慢的减缓期(progressive decelerational phase)和停止生长的静止期(stationary phase )。静止期的细胞数量和质量均会下降，如果继代不及时，长期处于停止期的细胞往往会出现死亡和生活力下降，从而影响整个悬浮细胞系的状态。因此在通常情况下，当细胞生长进入减缓期时就要及时继代。接种初期的细胞密度过低往往使延迟期加长，因此，根据培养目的的不同，悬浮细胞的起始密度一般可在每毫升(0.5-2.5)×105 个细胞间进行调整。如果只是一般继代培养，则可适当选择低密度接种，以延长培养周期，减少继代培养的操作。但如果希望在较短时间内获得大量活跃生长的细胞，则可适当提高接种密度，这样可缩短继代培养时间。起始密度通常通过细胞计数的方法确定。二、论述题（16 分）（请选择 1 道题作答，16 分/题）1. 根据体细胞无性系变异的特点，讨论如何诱变和筛选体细胞无性系变异体，并应用在哪些方面。答：（1）诱变方法① 物理诱变物理诱变主要是通过射线、磁场及温度等对培养物进行一定处理，然后对处理后的培养物进行培养筛选。常用的射线处理包括 x 射线、γ 射线、快中子和紫外线等。② 化学诱变化学诱变是通过在培养基中添加一些化学物质，细胞对这些化学物质吸收后直接或间接引起碱基突变。常用的化学诱变剂主要有：烷化剂 (硫酸二乙酯 DES，乙基磺酸乙酯EES，甲基黄酸乙酯 EMS，环氧乙烷 EO 和乙烯亚胺 EI 等)，此类诱变剂有一个或多个活化烷基，可与 DNA 分子中的碱基或磷酸基结合，改变 DNA 的结构而引起突变；碱基类似物(5-溴尿嘧啶是胸腺嘧啶类似物，2-氨基嘌呤是腺嘌呤类似物等)，在细胞内核酸复制时，这些类似物可以掺人到新合成的 DNA 分子中引起错配；移码诱变剂，如 ICR 化合物和吖啶类似物等。此外，亚硝酸、羟胺等某些抗生素亦可引起突变产生。化学诱变剂既- 4 - 是诱变因子，也是选择因子，因为正常细胞在加入上述诱变剂后一般不能正常生长，如果能在含有这些诱变剂的培养基中正常生长，多半属于发生突变的类型。特别是随着 DNA 分子结构特性研究的不断深入，采用碱基类似物和移码诱变剂，将有可能实现定点诱变。③ 复合因子诱变诱变处理可以是单因子处理，也可以是复合因子诱变。一般来说，复合诱变的效果比单因子诱变好。复合诱变处理的方法有：两种或两种以上的诱变剂同时使用或交替使用，同一种诱变剂连续重复使用等。④ 转座子插入诱变转座子插入诱变是近年来利用分子生物学技术发展起来的新的体细胞变异诱导方法。转座子既可直接将外源基因带人细胞内获得新性状，又可以独立插入通过其转座功能诱导变异。（2）体细胞突变体的筛选根据筛选时所采用的策略，筛选方法可分为两类：直接筛选法和间接筛选法。① 直接筛选法直接筛选法是在设计的选择条件下，能使培养细胞或再生个体获得直接感官上的差异，因此能将突变个体和非突变个体分离。最直接的做法是用一种含有特定物质的选择培养基，在此培养基上只有突变细胞能够生长，而非突变细胞不能生长，从而直接筛选出突变体。② 间接筛选法间接选择法是一种借助于与突变表型有关的性状作为选择指标的筛选方法。当缺乏直接选择表型指标或直接选择条件对细胞生长不利时，可考虑采用间接筛选法。例如，脯氨酸(Pro)作为一种渗透调节物质，在维持细胞膜稳定性、细胞水分平衡等方面具有重要的生物学意义。鉴定显示，抗寒愈伤组织及其再生植株的抗寒性分别比供体提高 1.4℃和2.4 ℃，突变系体内的 Pro 含量比供体增加一倍。- 5 -